Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) характеризуются хроническим воспалением желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которым страдают более 6 млн человек во всем мире [1, 2]. Болезнь Крона (БК) – это сегментарное, асимметричное и трансмуральное воспаление, которое может поражать весь ЖКТ, но чаще наблюдается в подвздошной и толстой кишках. ЯК связан с воспалением слизистой оболочки от прямой кишки до проксимального отдела толстой кишки [3–5]. Лечение ВЗК имеет первостепенное значение для качества жизни пациентов, поскольку заболевание оказывает большое влияние на физические, психологические и социальные аспекты жизни. В этиологии заболевания сочетаются несколько факторов: генетическая предрасположенность, дефекты врожденного и приобретенного иммунитета, неблагоприятные изменения кишечной микрофлоры, а также факторы окружающей среды. Под воздействием факторов риска происходят активация Th1/Th2, гиперэкспрессия провоспалительных цитокинов. В результате происходит формирование лимфоплазмацитарной инфильтрации с деструкцией стенки толстой кишки с характерными макроскопическими изменениями и развитием клинической картины. В 30% случаев отмечается непереносимость препаратов базисной терапии (5-аминосалициловой кислоты, глюкокортикостероидов), поэтому по-прежнему актуальны разработка и внедрение в лечебную практику эффективных стратегий по терапии ВЗК [6]. Ранее в эксперименте нами продемонстрирован положительный эффект локального применения при ВЗК куркумина, витамина D3, эритропоэтина в составе оригинальных лекарственных средств [7–9]. К методам патогенетической терапии можно отнести физические методы, которые не являются альтернативой фармакологическим методам, но которые могут дополнять, потенцировать действие лекарственных средств. В этом отношении перспективным направлением в медицине представляется применение медицинского озона за счет его противовоспалительного, антиоксидантного, иммуномодулирующего действия.

Цель исследования. Оценить противовоспалительный эффект озона при внутрибрюшинном применении при экспериментальном колите.

Материалы и методы исследования. Эксперимент одобрен этическим комитетом федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Воровского 64, Челябинск, Россия), протокол № 1 от 22.05.2020 г. Животных содержали согласно стандартам в условиях вивария. Обращение с животными соответствовало правилам гуманного отношения и выведения из опыта животных, определенным Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22.09.2010 г. по охране животных для научных целей. Материалом для исследования послужили 72 крысы линии Wistar массой 220±10 г, которых с помощью генератора случайных чисел разделили на 4 группы: I (n=9) — интактный контроль, II (n=21) — животные с оксазолон-индуцированным колитом (ОИК), III (n=21) — животные с ОИК на фоне внутрибрюшинной инсуффляции ОКС, IV (n=21) — животные с ОИК, получающие ректальные суппозитории с 5-аминосалициловой кислотой (5-АСК). Применяли внутривенную анестезию золетилом в дозировке 0,02 г/кг (МНН: тилетамина гидрохлорид) (Virbac Sante Animale; Фpaнция). ОИК моделировали с помощью двух этапов применения 3%-ного спиртового раствора оксазолона (4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-он). На первом этапе сенсибилизировали кожу путем нанесения 675 мкл/кг спиртового раствора оксазолона на область между лопаток, во втором этапе ректально вводили 675 мкл/кг в толстую кишку на глубину 7 см [10]. Озонокислородную смесь (ОКС) получали на аппарате «УОТА-60-01» («Медозон», Россия). Верификацию ОИК проводили по оценке морфологии участка повреждения в толстой кишке. Суппозитории с 50 мг 5-АСК в каждом суппозитории для крыс готовили на основе препарата «Салофальк» (МНН: Месалазин, «Doctor Falk Pharma GmbH», Германия). Животных выводили из эксперимента на 2-е, 4-е и 6-е сутки от индукции ОИК. Определяли диаметр язвенного дефекта, плотность сосудистой сети, оценивали повреждения толстой кишки по индексу повреждения тканей (tissue damage index, TDI) от 0 до 6 с учетом лейкоцитарной фильтрации, плотности сосудов и толщины стенки кишечника, площади повреждения, утраты бокаловидных клеток [11]. Общее количество лейкоцитов в крови исследовали на гематологическом анализаторе, откалиброванном для крови крыс, «ВС-2800Vet» («Mindray», Китай). Концентрацию в сыворотке С-реактивного белка (С-РБ) определяли с помощью специфической для крыс тест-системы («ElisaKit», Китай). Полученные данные обрабатывали с помощью программы IBM SPSS Statistics v. 19. Характеристика выборок представлена в виде «Me (Q1; Q3)», где Мe – медиана, Q1 и Q3 – значение нижнего и верхнего квартиля соответственно. Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием непараметрических критериев (Манна–Уитни, Вальда–Вольфовитца, Краскелла–Уоллиса). Статистические различия между группами с учетом поправки Бонферрони считали значимыми при p≤0,02.

Результаты исследования и их обсуждение. Отражением развития ОИК является морфологическая картина толстой кишки: на 2-е сутки в очаге повреждения отмечены язвенные дефекты в слизистой оболочке, подслизистый слой разрыхлен, резко утолщен за счет выраженного отека, увеличена плотности сосудистой сети; TDI варьировал от 2 до 3 ед. На 4-е и 6-е сутки увеличение TDI происходило преимущественно за счет дальнейшего увеличения размера язвенного дефекта, толщины стенки кишечника без значимого увеличения плотности сосудистой сети; TDI варьировал от 3 до 4 ед. и в динамике ОИК на 4-е и 6-е сутки был больше (р<0,01), чем на 2-е сутки (табл. 1). Изменения в очаге повреждения, связанные с воспалительным процессом, нашли отражение в показателях ответа острой фазы в крови (табл. 2). На 2-е сутки ОИК в крови увеличивалось количество лейкоцитов за счет палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов. На 2-е, 4-е и 6-е сутки ОИК наблюдалось увеличение количество лейкоцитов в крови за счет сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов (только на 6-е сутки). Наряду с этим на 2-е, 4-е и 6-е сутки повышалась концентрация С-РБ в сыворотке. В динамике ОИК на 4-е и 6-е сутки в крови общее количество лейкоцитов и сегментоядерных нейтрофилов меньше (р<0,01), чем на 2-е сутки, количество эозинофилов и концентрация С-РБ в сыворотке больше (р<0,01), чем на 2-е сутки.

Таким образом, при ОИК на 2-е, 4-е и 6-е сутки увеличиваются индекс повреждения ткани толстой кишки TDI, количество лейкоцитов в крови преимущественно за счет лимфоцитов, С-РБ в сыворотке; максимальная выраженность морфологических признаков повреждения в толстой кишке и концентрации С-РБ в сыворотке – на 4-е и 6-е сутки, максимальные количество в крови нейтрофилов, моноцитов – на 2-е сутки. Морфологическая картина поражения толстой кишки, показатели ответа острой фазы в крови при ОИК соответствуют изменениям при ВЗК у человека, что способствует применению оксазолоновой модели колита для изучения патогенеза и апробации эффективности применения новых терапевтических стратегий при ВЗК [12].

Применение ОКС при ОИК в очаге повреждения на 2-е, 4-е, 6-е сутки приводило к сокращению диаметра язвенного дефекта, увеличению площади распределения сосудов, снижению интегрального показателя повреждения ткани TDI (табл. 1). Полагаем, что увеличение площади сосудов отражает пролиферацию неоангиогенеза и ускорение репаративных реакций в области повреждения.

Ранее нами показано, что внутрибрюшинные инсуффляции озона при ОИК усиливают окислительную деструкцию белков и липидов в очаге повреждения толстой кишки на 2-е сутки, что обусловлено прямыми окислительными свойствами озона, его способностью выступать в качестве прооксиданта [13]. На начальных этапах воспаления озон активирует факторы транскрипции, такие как HIF-1α и NF-kβ, повышает продукцию провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и TNF-α [14]. Наряду с этим обнаружены системные изменения в крови при ОИК в условиях внутрибрюшинного применения озона (табл. 2). Количество лейкоцитов в крови снижалось на 2-е, 4-е и 6-е сутки преимущественно за счет лимфоцитов, палочкоядерных нейтрофилов на 2-е сутки, эозинофилов – на 4-е сутки и моноцитов – на 6-е сутки; на 4-е сутки увеличивалось количество сегментоядерных нейтрофилов в крови. Общее количество лейкоцитов и нейтрофилов на 2-е, 4-е и 6-е сутки, количество лимфоцитов и моноцитов на 2-е сутки значимо отличалось от аналогичных показателей контрольной группы. Концентрация в сыворотке С-РБ снижалась на 4-е и 6-е сутки, но не достигла уровня интактных животных на 6-е сутки ОИК.

Таким образом, при экспериментальном ОИК в условиях внутрибрюшинного применения озона на 4-е и 6-е сутки наблюдения снижается выраженность морфологических признаков повреждения толстой кишки по показателю TDI, снижается концентрация С-РБ в сыворотке; на 2-е, 4-е, 6-е сутки снижается в крови общее количество лейкоцитов и количество лимфоцитов. Полагают, что противовоспалительные эффекты озона реализуются за счет активации транскрипционного фактора Nrf2, Nrf2-опосредованной Keap1-зависимой активации синтеза СОД, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, глутатион-S-трансферазы, гемоксигеназы, НАДФН-хиноноксидоредуктазы-1 и иных ферментов антиоксидантной защиты [15]. Кроме этого, Nrf2 подавляет активность NF-kβ и продукцию провоспалительных цитокинов за счет прямых белок-белковых взаимодействий при умеренном окислительном стрессе под воздействием озона. Данный эффект озона потенцируется ингибицией NLRP3 и ограничением синтеза IL-1β и IL-18.

На фоне применения 5-АСК при ОИК отмечены противовоспалительные свойства: на 2-е, 4-е, 6-е сутки – снижение количества лейкоцитов в крови за счет нейтрофилов и моноцитов, концентрации в сыворотке С-РБ (табл. 2). Данные факты нашли отражение в морфологической картине: снижении TDI на 4-е и 6-е сутки наблюдения, уменьшении размера язвенного поражения на 2-е, 4-е, 6-е сутки, увеличении площади распределения сосудов в очаге повреждения на 4-е и 6-е сутки (табл. 1).

Таблица 1

Морфометрические данные в очаге повреждения толстого кишечника при ОИК (Ме (Q1; Q3))

Таблица 2

Влияние применения ОКС или 5-АСК на количественный состав лейкоцитов и СРБ в крови при ОИК (Ме (Q1; Q3))

Противовоспалительный эффект при ОИК в условиях применения внутрибрюшинных инсуффляций ОКС по сравнению с применением ректальных суппозиториев с 5-АСК оказывает менее выраженный эффект на снижение выраженности морфологических признаков повреждения в толстой кишке, за исключением уменьшения площади распределения сосудов; системные признаки воспаления, включая количество в крови нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов, концентрацию С-РБ, уменьшаются более выраженно при применении 5-АСК, а не озона.

Выводы

1. При ОИК в динамике 6-суточного наблюдения максимальная выраженность морфологических признаков повреждения в толстой кишке и концентрации С-РБ в сыворотке отмечается на 4-е и 6-е сутки и количество в крови нейтрофилов, моноцитов – на 2-е сутки.

2. При ОИК внутрибрюшинные инсуффляции озона в дозе 0,05 мг/кг ежедневно приводят на 4-е и 6-е сутки наблюдения к снижению морфологических признаков повреждения толстой кишки по показателю TDI, снижению концентрации С-РБ в сыворотке; на 2-е, 4-е, 6-е сутки – к снижению количества в крови лейкоцитов преимущественно за счет лимфоцитов.

3. Эффекты при ОИК внутрибрюшинных инсуффляций озона по сравнению с эффектами применения каждые 12 ч ректальных суппозиториев с 50 мг 5-АСК менее выражены в отношении морфологической картины по данным TDI, снижения концентрации С-РБ в сыворотке и количества лейкоцитов в крови на 2-е, 4-е, 6-е сутки; более выражены в отношении площади распределения сосудов на 2-е и 6-е сутки.