Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) – это нетепловая доставка фотонов в видимом или ближнем инфракрасном диапазоне (405-1000 нм) с низкой мощностью (1–500 мВт), которая вызывает благоприятный биологический ответ в клетках и тканях. НИЛИ стимулирует повышенное окисление цитохром-С-оксидазы и увеличение скорости переноса электронов в митохондриях, что приводит к увеличению производства АТФ и оказывает многие положительные влияния на ткани. Отсутствие значимых побочных эффектов и минимальное число противопоказаний делает лазерное излучение перспективным методом терапии во многих областях медицины. В последнее время появились работы, в которых НИЛИ используется для стимуляции мезенхимных стволовых клеток (МСК), локализующихся в красном костном мозге или жировой ткани [1]. Высокая скорость пролиферации, способность к дифференцировке в разные клеточные линии, а также возможность получения клеток для трансплантации из собственных тканей организма делает перспективным использование МСК в практической медицине. Исследования in vivo и in vitro продемонстрировали положительное влияние НИЛИ на выживаемость МСК, полученных из жировой ткани, и секрецию ими факторов роста. Установлено также кардиопротекторное действие НИЛИ [2]. Однако благотворное влияние МСК на работоспособность миокарда имеет некоторые ограничения, связанные с доставкой выделенных и культивированных МСК в сердце, низкими показателями их приживления в поврежденных участках миокарда [3]. Поэтому в настоящее время осуществляется поиск оптимальных методов введения или доставки МСК в миокард. Одним из них является облучение лазером тканей, богатых МСК, с целью усиления их миграционной способности. Zaynab H. с соавторами [4] опубликовали данные о том, что при облучении красного костного мозга с помощью НИЛИ, имеющего длину волны 804 нм и дозу 1 Дж/см2, происходит усиление пролиферации МСК и осуществляется их миграция в сердце. По сравнению с красным костным мозгом именно жировая ткань обладает более многочисленным резервом МСК, их легче получить с меньшим количеством осложнений [5]. Однако в доступной литературе авторы не нашли информации о влиянии облучения сальника с помощью НИЛИ на усиление миграции МСК в сердце.

Цель исследования – изучить в сравнительном аспекте изменения гистологического строения сердца и сальника, установить особенности экспрессии в них маркеров, характерных для пролиферирующих и мезенхимных стволовых клеток, для оценки возможной миграции МСК из сальника в сердце при облучении экспериментальных крыс низкоинтенсивным инфракрасным лазером, применяемым десятикратно на область передней брюшной стенки с помощью аппарата «Узор А-2К» с лучевой нагрузкой 0,5-1,0 Дж/см2 и длиной волны 890 нм.

Материалы и методы исследования

Исследование проведено на беспородных белых крысах (самцах, средняя масса тела 379,00±15,45 г). Методом слепой выборки животные были разделены на группы: основную - группу 1, крысы которой (n=8) получали низкоинтенсивное инфракрасное лазерное облучение длиной волны 890 нм с помощью аппарата «Узор А-2К» на область передней брюшной стенки в дозе 0,5-1,0 Дж/см2, с экспозицией 5 минут, десятикратно; контрольную – группу 2 (n=8), животные которой подвергались таким же подготовительным мероприятиям, что и в группе 1, но не были облучены.

Для выведения из эксперимента животных по одному помещали в стеклянный сосуд, содержащий кусочек ваты, пропитанный этиловым эфиром в дозе, в 3 раза превышающей наркотическую. После засыпания животного с целью эвтаназии применяли цервикальную дислокацию. Все процедуры эвтаназии проводили с соблюдением этических принципов «Европейской Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в других научных целях» (Страсбург, 18 марта 1986 г.). Для проведения эксперимента было получено разрешение Локального этического комитета ФГБОУ ВО «Пермский ГМУ им. академика Е.А. Вагнера» Минздрава России, протокол № 3 от 11 марта 2019 года.

У животных забирали сальник и сердце в области верхушки, фиксировали в забуференном нейтральном формалине, заливали в парафин, препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Для проведения иммуногистохимических реакций c целью выявления в тканях мезенхимных стволовых клеток применяли кроличьи моноклональные противокрысиные антитела системы Diagnostic Biosystems, с помощью которых определяли экспрессию в клетках сальника и сердца CD73, CD90, CD105, CD34 и CD45. Использовали антитела к СD73 (ab175396), CD90 (ab92574), CD105 (ab231673), CD 34 (ab81289) и СD45 (ab10558), для определения пролиферирующих клеток выявляли экспрессию Ki-67(ab15580). Окрашивание проводили согласно протоколу с использованием системы детекции HRP/DAB DetectionSistem. Для определения специфичности окрашивания применяли отрицательный контроль, для проведения которого при окрашивании срезов первичное антитело заменяли раствором фосфатного буфера. После окрашивания гистологических препаратов в левом желудочке сердца осуществляли подсчет клеток, экспрессирующих соответствующие антигены, в 4 зонах: в стенке кровеносных сосудов (зона 1), в субэпикардиальной зоне миокарда (зона 2), в субэндокардиальной зоне миокарда (зона 3) и в средней части миокарда (зона 4). В сальнике подсчет клеток проводили в стенке и вокруг кровеносных сосудов (зона 1) и в участках локализации фибробластоподобных клеток (ФПК) (зона 2). В каждой зоне сальника и сердца при увеличении микроскопа на 1000 подсчет осуществляли в 10 полях зрения с вычислением процентного содержания положительно окрашенных клеток. Микроскопирование и фотографирование препаратов проводили с помощью микроскопа «Ломо Микмед-6» и цифровой фотокамеры ToupCam.

Статистическая обработка полученных данных проводилась на ПК с использованием встроенного пакета анализа табличного процессора Excel® 2016 MSO и пакета прикладных электронных таблиц (ППЭТ) Stat2015. При совпадении показателей средней арифметической (М) и медианы (Ме) для оценки показателей использовались методы параметрической статистики. Для определения достоверного различия дисперсий признаков применялся критерий Фишера (F), при оценке статистической достоверности различий использовали двухвыборочный критерий Стьюдента (t); при отсутствии нормального распределения применялся U-критерий Манна - Уитни (U). Вычисляли средние показатели (M) и ошибку репрезентативности средней арифметической (m). Различия между группами считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В сальнике животных экспериментальной группы под действием НИЛИ наблюдали расширение сосудов микроциркуляторного русла, появление периваскулярных полиморфноклеточных и лимфомакрофагальных инфильтратов разных размеров (рис. 1A). Адипоциты, расположенные в участках воспаления, имели признаки липолиза, часть клеток подвергалась деформации и разрушению (адипоцитолиз) (рис. 1B).

Рис. 1. Сальник животных экспериментальной группы (группа 1): A – воспалительный инфильтрат; B – адипоциты в состоянии липолиза (указаны стрелками). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х1000

В зонах адипоцитолиза располагались клетки многоугольной или веретеновидной формы, имеющие фенотип фибробластов (фибробластоподобные – ФПК). ФПК формировали пласты, вокруг которых отмечалось развитие соединительной ткани.

Известно, что основным фотоакцептором НИЛИ в клетках млекопитающих является цитохром–С-оксидаза митохондрий, поглощающая свет в диапазоне от 630 до 900 нм. Под влиянием НИЛИ происходит повышение окисления цитохром–С-оксидазы, ускорение переноса электронов и увеличение синтеза АТФ в клетках. Некоторые молекулы, например мембранные хромофоры, после поглощения фотона света переходят на некоторое время в возбужденное состояние, взаимодействуют с кислородом, что приводит к образованию реакционноспособного синглетного кислорода. Изменение метаболизма митохондрий и активация дыхательной цепи путем светового воздействия увеличивает также производство супероксид-анионов и перекиси водорода [6]. Образование активных форм кислорода при воздействии НИЛИ вызывает повреждение клеточных мембран адипоцитов и выход из цитоплазмы эндогенных молекул, в том числе жирных кислот и провоспалительных цитокинов [7]. Жирные кислоты и другие молекулы, выделяемые во внеклеточное пространство, действуют как молекулярный фрагмент, ассоциированный с повреждениями (DAMP – damage associated molecular pattern), активируя макрофаги жировой ткани через toll - подобный рецептор 4 типа. Активация макрофагов вызывает продукцию ими фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) и других провоспалительных молекул, что способствует развитию локального воспаления и разрушению части адипоцитов. Таким образом, в нашем эксперименте в сальнике экспериментальных животных с помощью НИЛИ, имеющего длину волны 890 нм и лучевую нагрузку 0,5-1 Дж/см2, был получен липолитический эффект, который сопровождался развитием местного воспаления. Исходом воспалительного процесса в сальнике стало появление очагов скопления ФПК и формирование соединительной ткани. Согласно данным литературы, НИЛИ оказывает прямое стимулирующее действие на пролиферацию и миграцию фибробластов, а также на их трансформацию в коллаген-синтезирующие миофибробласты [8].

В сердце животных экспериментальной группы установлено полнокровие вен и неравномерное расширение капилляров. В периваскулярных участках миокарда были выявлены лимфоидные инфильтраты с примесью гранулоцитов, появление клеток с фенотипом ФПК и нарушение правильной организации кардиомиоцитов в функциональные волокна (рис. 2А). При подсчете числа клеток в поле зрения микроскопа в зоне 4 было установлено увеличение количества адипоцитов с 16,4±8,2 до 39,9±20,8 (t=3,277, р<0,01) (рис. 2В).

Рис. 2. Сердце животных основной группы (группа 1): А – лимфоидный инфильтрат в миокарде; В - липоматоз стромы миокарда (адипоциты указаны стрелками). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х400

Морфологические изменения в сердце экспериментальных крыс могут быть связаны с кратковременным увеличением под действием НИЛИ продукции провоспалительных цитокинов [9], что вызывает изменение проницаемости кровеносных сосудов и усиление миграции лейкоцитов в строму миокарда. Развитие адипоцитолиза и липолиза в адипоцитах сальника под действием лазерного облучения приводит к увеличению содержания в крови животных группы 1 свободных жирных кислот (СЖК) [10]. Повышение проницаемости кровеносных сосудов сердца может способствовать поступлению СЖК в ткани и их проникновению в цитоплазму стромальных клеток и ФПК, так как преадипоциты, имеющие фенотип ФПК, экспрессируют гликопротеин CD36/FAT и внутриклеточные ацил-КоА-синтетазы, которые увеличивают поглощение жирных кислот за счет прямого транспорта через плазматическую мембрану [11]. Накопление СЖК в клетке приводит к развитию окислительного стресса и митохондриальной дисфункции, вызывает активацию факторов транскрипции: связывающего стеролрегулирующего элемента (SREBP-1c) и рецептора, активируемого пероксисомными пролифераторами γ (PPARγ), которые запускают механизм липогенеза в клетках и способствуют, таким образом, увеличению числа адипоцитов в строме миокарда [12].

Иммуногистохимическое исследование показало, что в сальнике животных группы 1 в участках локализации ФПК происходило увеличение количества клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для МСК – CD73, CD90, CD105. В этих же зонах установлено статистически значимое увеличение количества пролиферирующих клеток, экспрессирующих Ki-67 (табл. 1). Экспрессия соответствующих маркеров наблюдалась в клетках с фенотипом перицитов и адвентициальных клеток. В то же время сами ФПК не экспрессировали данные антигены. Содержание в сальнике клеток, экспрессирующих СD34 и CD45, соответствовало контролю. Установленная в сальнике у крыс группы 1 одинаковая динамика клеток, экспрессирующих СD73, CD90, CD105, при отсутствии изменений в содержании клеток, положительно окрашивающихся на CD45 и CD34, позволяет рассматривать эти клетки как МСК.

Таблица 1

Динамика процентного содержания клеток, экспрессирующих маркеры CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, Ki-67, в сальнике животных групп 1 и 2 (M±2m)

Примечание: ↑ - увеличение числа клеток относительно контроля; р<0,05.

Увеличение содержания МСК в сальнике под действием лазерного облучения может быть вызвано двумя факторами. Первым из них является развитие в сальнике воспаления. Вторым фактором становится непосредственное стимулирующее действие лазерного облучения на пролиферативную активность и дифференцировку МСК. Было обнаружено, что облучение инфракрасным светом активирует сигнальные каскады, которые способствуют клеточной пролиферации [13].

В сердце животных основной группы 1 в отдельных зонах установлено уменьшение содержания клеток, экспрессирующих некоторые маркеры, характерные для МСК (CD73, CD90, CD105). Однако эти изменения в основном не имели статистически значимой достоверности (табл. 2). Экспрессия Ki-67 (за исключением зоны 3), CD45 и CD34 в клетках миокарда находилась на контрольном уровне.

Таблица 2

Динамика процентного содержания клеток, экспрессирующих CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 и Ki-67 в сердце животных групп 1 и 2 (M±2m)

Примечание: ↓ - уменьшение числа клеток относительно контроля; р<0,05.

Таким образом, облучение НИЛИ сальника в наших экспериментах не привело к усилению миграции МСК в сердце. Это может быть связано с тем, что нами были взяты животные без индуцируемой кардиальной патологии, у которых отсутствовал цитокиновый вектор, стимулирующий миграцию и пролиферацию стволовых клеток, так как известно, что активация стволовых клеток сердца или усиление миграции МСК происходят на фоне повреждения миокарда, например при инфаркте или аортальном стенозе [14]. В современных исследованиях установлено, что в условиях гипоксии увеличивается выживаемость и миграционная активность МСК [15]. Другой причиной отсутствия динамики МСК в сердце может явиться разная чувствительность тканей сердца и сальника к лазерному облучению, так как эффекты НИЛИ могут значительно различаться в разных тканях и клетках в зависимости от уровня окислительно-восстановительных потенциалов, наличия и порога фотоактивации хромофорных молекул и других факторов.

Выводы

1. Десятикратное облучение сальника экспериментальных крыс низкоинтенсивным инфракрасным лазером в дозе 0,5-1,0 Дж/см2 при длине волны 890 нм вызвало липолиз в адипоцитах и их адипоцитолиз, а также стимуляцию регенераторного потенциала органа, что проявилось увеличением количества МСК и пролиферирующих клеток, наблюдаемым на фоне развития воспалительной реакции.

2. В сердце экспериментальных крыс под действием лазерного облучения в дозе 0,5-1,0 Дж/см2 при длине волны 890 нм установлено развитие липоматоза и отсутствие динамики в содержании МСК и пролиферирующих клеток, что говорит об отсутствии миграции МСК из сальника в сердце.