Цитокины являются важными медиаторами воспалительной реакции при инфекции SARS-CoV-2. Многие клинические характеристики COVID-19 объясняются действием провоспалительных цитокинов [1]. Накопленные исследования показали, что ИЛ-1β и ТНФ-α могут стимулировать секрецию других цитокинов и поэтому известны как цитокины ранней фазы. После стимуляции патогенными факторами ИЛ-1β и ТНФ-α быстро секретируются, достигая пика через несколько часов. Впоследствии организм начинает выделять противовоспалительные цитокины для обеспечения противодействия стимуляции, вызванной вредными патогенами, и поддержания клеточного гомеостаза. Однако при постоянной сильной стимуляции патогенами или чрезмерных иммунных ответах равновесие между провоспалительными и противовоспалительными реакциями нарушается [1]. Цитокины ранней фазы могут дополнительно способствовать активации и высвобождению ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, вызывая каскадоподобный процесс, тем самым приводя к неконтролируемому воспалению.

С момента появления COVID-19 у взрослых описаны аномально высокие уровни цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-17, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, ИП-10, ИНФ-γ, МСП-1, ТНФ-α [2, 3]. C.A. Pierceet al. сообщили, что у детей с легким клиническим течением COVID-19 выявлены низкие концентрации ИЛ-6, ТНФ-α и ИП-10 по сравнению со взрослыми с тяжелым исходом [4].И наоборот, уровни ИЛ-17A и ИНФ-γ оказались выше у пациентов до 24 лет относительно показателей взрослых, подтверждая зависимость цитокинов, особенно ИЛ-17A, от возраста [5]. При детском мультисистемном воспалительном синдроме описано повышение провоспалительных цитокинов, таких как ИНФ-γ, ИЛ-1β, ИЛ-10, ИЛ-6, ИЛ-17 и ИЛ-8 [6].

Респираторно-синцитиальный вирус, аденовирус усиливали выработку ИЛ-6 макрофагами человека, влияя на восприимчивость и тяжесть респираторных инфекций. Более того, вирус гриппа А вызывал острую воспалительную реакцию, характеризующуюся выработкой провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-33 и ИЛ-6, в инфицированных легких, что указывает на ключевую роль этих интерлейкинов в патогенезе респираторных заболеваний, повреждении эпителиальных клеток и воспалении легких. Все же профиль большинства цитокинов в отношении клинических проявлений, тяжести заболевания и исходов у детей с коронавирусной инфекцией до сих пор остается неясным.

Общепризнано, что иммунный ответ детей сильно различается в зависимости от возраста и по сравнению со взрослыми. Ответы на неизвестные вопросы о COVID-19 у детей могут быть связаны с цитокинами и иммунологическими механизмами. Выявление четкого профиля цитокинов и патофизиологических особенностей вызванного SARS-CoV-2 «цитокинового шторма» имеет практическое значение, поскольку может предсказать клиническое ухудшение, например необходимость интубации, перевода в палату интенсивной терапии, смертность. Учитывая противоречивые результаты, ограниченные данные о профиле цитокинов у пациентов школьного возраста, основной целью исследования авторы поставили изучение сывороточных уровней ключевых цитокинов, участвующих в адаптивном иммунитете, – провоспалительных (ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-17А, ТНФ-α) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИНФ-γ, ИЛ-10, ИЛ-12p70, ТГФ-b1), а также цитокинов с хемотаксическим эффектом (ИЛ-8, ИП-10, МСП-1) у детей и подростков при COVID-19.

Многими исследователями до сих пор изучается причинно-следственная связь между тяжестью коронавирусной инфекции и различными биомаркерами, в том числе цитокинами, преимущественно у взрослых при среднетяжелых, тяжелых и крайне тяжелых формах коронавирусной инфекции [1, 2].Для понимания легкого течения заболевания у детей важно рассмотреть иммунологические сдвиги в зависимости от возраста и степени тяжести COVID-19. Сообщалось, что возраст является важным фактором, связанным с тяжестью заболевания у детей с COVID-19 [7–9]. В Китае из 2135 детей с COVID-19 доля пациентов младше 1 года составила 10,6 % тяжелых и критических случаев, что является самым высоким показателем среди всех детских возрастных групп [], эти результаты свидетельствуют, что младенцы могут быть уязвимы для инфекции SARS-CoV-2. Аналогичным образом в Колорадо, США, среди 36 000 случаев заболевания SARS-CoV-2 у детей предиктором тяжелого течения COVID-19 установлен возраст младше 3 месяцев или старше 20 лет [8]. В другом исследовании, включавшем 177 детей и молодых взрослых пациентов с COVID-19, отмечено, что дети до 1 года и старше 15 лет представляли наиболее многочисленную долю пациентов среди госпитализированных лиц [9]. Однако, в отличие от вышеупомянутых результатов, во Франции самый низкий уровень тяжелых форм COVID-19 отмечен у детей до 3 месяцев жизни, несмотря на высокое (37 %) число госпитализированных детей [10]. Это несоответствие, возможно, обусловлено различными определениями тяжелых форм заболевания в разных исследованиях.

Клинические проявления и тяжесть инфекций SARS-CoV-2 демонстрируют четкую корреляцию с возрастом пациента: чем моложе человек, тем меньше вероятность того, что инфекция приведет к негладкому течению заболевания. Стоит отметить, что бессимптомные и легкие случаи, преобладающие в детском возрасте, представляют собой скрытые инфекции SARS-CoV-2, которые могут стать причиной новых вспышек и требуют надлежащего внимания. Поэтому авторы дополнительно провели анализ цитокинового профиля сыворотки крови детей с COVID-19 в зависимости от формы тяжести заболевания в сравнении со здоровыми.

Цель исследования – установить цитокиновый профиль (ИЛ-17A, ТНФ-α, ИЛ-8, ИЛ-1β, ТГФ-b1, ИЛ-2, ИЛ-12p70, ИЛ-4, ИНФ-γ, ИЛ-6, МСП-1, ИЛ-10, ИП-10) сыворотки крови детей школьного возраста при COVID-19.

Материалы и методы исследования

Проведено одномоментное исследование, включающее детей (основная группа), последовательно госпитализированных в инфекционное отделение ГУЗ «Городская клиническая больница № 1» (г. Чита), на базе которого развернут первый и единственный на момент исследования моностационар для оказания медицинской помощи больным с коронавирусной инфекцией, в том числе детям, на территории Забайкальского края в период с апреля по июль 2020 г.

В контрольную группу приглашали здоровых детей, проходивших в указанный период ежегодный плановый профилактический медицинский осмотр в центре здоровья Детского клинического медицинского центра (г. Чита). Данный центр выбран в связи с согласием руководства (администрации) сотрудничать с нами. Окончательное количество возможных участников исследования сформировано на основании информации, полученной из медицинской документации детей (форма № 026/у-2000, форма № 112/у). Согласно критериям включения в группу контроля включены дети I–II группы здоровья. В период с апреля по июль 2020 г. авторы созванивались по контактному номеру телефона, указанному в амбулаторной карте пациента, с родителями или иными законными представителями детей и приглашали их с детьми в центр здоровья для уточнения соответствия критериям отбора и забора венозной крови.

Критерии включения в основную группу: пациенты в возрасте 7–17 лет, положительный тест на инфекцию COVID-19; подписанное согласие родителя (законного представителя) или самого пациента в возрасте старше 15 лет на участие в исследовании. Критерии невключения в основную группу: не запланированы. Критерии включения в группу контроля: отрицательный результат на SARS-CoV-2; дети с I–II группой здоровья на момент обследования (по данным медицинской документации и осмотра педиатра); возраст 7–17 лет; отсутствие инфекций дыхательных путей на протяжении последних 3 месяцев; подписанное согласие от пациентов старше 15 лет и родителей или законных представителей для детей младше 15 лет. Критерии невключения в группу контроля: дети III–V групп здоровья на момент обследования (по данным медицинской документации и заключения педиатра); наличие инфекций дыхательных путей на протяжении последних 3 месяцев, возраст младше 7 лет и старше 17 лет; отказ родителей ребенка и пациентов, достигших 15-летнего возраста и старше, от участия в исследовании.

Информация о клиническом диагнозе «коронавирусная инфекция», клинико-эпидемиологические характеристики, результаты компьютерной томографии или рентгенографии органов грудной клетки, лабораторные данные каждого пациента получены из электронной истории болезни. Верификация диагноза «коронавирусная инфекция» проведена врачом инфекционистом во время госпитализации в ГУЗ «Городская клиническая больница № 1» в период с апреля по июль 2020 г. в соответствии с методическими рекомендациями «Особенности клинических проявлений и лечения заболевания, вызванного новой коронавирусной инфекцией (COVID-19) у детей: версия 1 (утв. Министерством здравоохранения Российской Федерации 24.04.2020)».

Сведения о форме тяжести коронавирусной инфекции, диагностированные врачом-инфекционистом во время госпитализации, взяты из медицинской документации (история болезни). При оценке тяжести коронавирусной инфекции у детей использованы критерии тяжести течения, опубликованные в методических рекомендациях. Пациенты, у которых не было жалоб, клинических проявлений и рентгенологических изменений, но выявлен положительный результат на SARS-CoV-2 с помощью ПЦР после контакта с членом семьи, больным COVID-19, классифицировались как бессимптомные. Легкая форма COVID-19 определялась при наличии у пациентов одного из следующих критериев: повышение температуры тела менее 38,5 °С, признаки интоксикации (миалгия, слабость), респираторно-катаральный синдром (кашель, боль в горле, заложенность носового дыхания), локальные изменения в ротоглотке, отсутствие изменений при аускультации легких, гастроинтестинальные симптомы (тошнота, рвота, боль в животе, диарея), кожные высыпания. Среднетяжелая форма COVID-19 устанавливалась пациентам, у которых наблюдалось повышение температуры тела свыше 38,5 °С, сухой, малопродуктивный кашель, пневмония, выслушивание сухих или влажных хрипов при аускультации легких без явных признаков дыхательной недостаточности (одышка) и гипоксемии, сатурация кислорода выше 93 % на протяжении развития заболевания, не требовалась госпитализация в отделение интенсивной терапии, но на компьютерной томограмме (КТ) грудной клетки определялись изменения, характерные для вирусного поражения легких легкой или среднетяжелой степени (КТ1-2).

Результаты о лабораторном подтверждении инфекции SARS-CoV-2 (положительный результат полимеразной цепной реакции (ПЦР) в назофарингеальных мазках) взяты из историй болезни детей. Исследования выполнены в лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Забайкальском крае».

Уровни цитокинов в детской сыворотке крови измеряли с помощью проточной флюориметрии. Образцы анализировали на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter, США), применяя панель LEGENDplexTM Human Essential Immune Response Panel, (BioLegend, США) и соблюдая инструкцию производителя, количественное содержание цитокинов выражали в пикограмме вещества на миллилитр (пг/мл). В состав панели вошли ИЛ-17A, ТНФ-α, ИЛ-8, ИЛ-1β, ТГФ-b1, ИЛ-2, ИЛ-12p70, ИЛ-4, ИНФ-γ, ИЛ-6, МСП-1, ИЛ-10, ИП-10. В течение 48 ч от момента госпитализации натощак с 8 до 9 ч утра с использованием системы Vacutainer (Kometaline, КНР) у детей основной группы осуществлялся забор венозной крови путем венепункции периферической вены. Образцы крови в качестве здоровых контролей для сравнения набраны в течение периода исследования. Тестирование проводили одномоментно после сбора биологического материала от всех участников в лаборатории экспериментальной и клинической биохимии и иммунологии НИИ молекулярной медицины Читинской государственной медицинской академии.

Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Читинской государственной медицинской академии (протокол № 101; дата подписания 15.04.2020 г.). Получено письменное информированное согласие на участие в исследовании от пациентов старше 15 лет и родителей (или иных законных представителей) для детей младше 15 лет.

Статистическая обработка. Размер выборки для основной и контрольной групп предварительно не рассчитывали. Анализ данных выполнен с применением пакета статистических программ IBM SPSS Statistics, версия 25.0 (IBM, США). С учетом численности исследуемых групп, анализ нормальности распределения количественных признаков проведен с помощью критерия Колмогорова – Смирнова. Распределение признаков отличалось от нормального во всех исследуемых группах, поэтому полученные данные представлены с указанием медианы (25-й; 75-й процентили). Для сравнения групп использован критерий χ2 Пирсона (качественные признаки) и U-критерий Манна – Уитни (количественные признаки). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Для сравнения более двух групп одновременно по одному количественному признаку использовали критерий Краскела – Уоллиса. При наличии статистически значимых различий проводилось попарное сравнение с помощью критерия Манна – Уитни с учетом поправки Бонферрони (статистически значимыми считали различия при р < 0,008).

Результаты исследования и их обсуждение

Сравниваемые группы статистически значимо не различались по полу и возрасту (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика обследуемых групп детей

Основная группа исследования, набранная во время пандемии, состояла из 98 детей с верифицированной коронавирусной инфекцией. Медиана возраста нашей когорты составила 13 [10; 14] лет, из них 54 % (53/98) – мальчики, 46 % (45/98) – девочки. Для проведения анализа пациенты основной группы дополнительно разделены на подгруппы в зависимости от степени тяжести коронавирусной инфекции: в 1 подгруппу вошли 16 (16 %) детей с бессимптомной формой, во 2 подгруппу – 54 (55 %) ребенка с легкой формой COVID-19, в 3 подгруппу – 28 (29 %) пациентов со среднетяжелой формой заболевания. Тяжелых случаев за период исследования не наблюдалось. Во время проведения исследования министерство здравоохранения Российской Федерации рекомендовало госпитализацию всех детей с COVID-19 для мониторинга, карантина и ограничения контактов, даже если не наблюдалось клинических проявлений, поэтому часть пациентов (16 %) в нашей работе не имели симптомов заболевания. Группу контроля сформировали 93 ребенка I–II групп здоровья соответствующего возраста (13 [10; 15] лет) и пола (47 % (44/93) мальчиков, 53 % (49/93) девочек).

На первом этапе исследования авторы сравнили уровни изучаемых цитокинов в образцах сыворотки между пациентами с новой коронавирусной инфекцией и контрольной группой. Медианный уровень ИЛ-4, ИЛ-2, ИП-10, ИЛ-1β, МСП-1, ИЛ-6, ИНФ-γ, ИЛ-8, ТГФ-b1 (табл. 2) у детей школьного возраста при коронавирусной инфекции на момент исследования статистически значимо выше при сопоставлении с детьми группы контроля (p < 0,05).

Таблица 2

Содержание цитокинов сыворотки крови у детей школьного возраста с COVID-19

В основной группе содержание ИЛ-17A, ИЛ-10, ИЛ-12p70 статистически значимо ниже аналогичных показателей контрольной группы (p < 0,05). Не установлено статистически значимой разницы в концентрации ТНФ-α между пациентами с COVID-19 и группой контроля (р = 0,398).

На втором этапе исследования авторы изучили цитокиновый профиль подгрупп пациентов в зависимости от степени тяжести COVID-19 (табл. 3).

Таблица 3

Содержание цитокинов сыворотки крови у детей школьного возраста с COVID-19 в зависимости от степени тяжести

Статистически значимых различий между подгруппами с бессимптомной, легкой и средней степенью тяжести коронавирусной инфекции в отношении концентрации ИЛ-17A, ТНФ-α, ИЛ-8, ИЛ-1β, ТГФ-b1, ИЛ-2, ИЛ-12p70, ИЛ-4, ИНФ-γ, ИЛ-6, МСП-1, ИЛ-10, ИП-10 не наблюдалось (p > 0,05).

Известно, что цитокины играют важную роль в иммунопатологии при вирусной инфекции. Недавние опубликованные исследования у взрослых продемонстрировали, что при COVID-19 уровень цитокинов значительно выше, чем у здоровых [11]. Как и у взрослых, у детей с COVID-19 в настоящем исследовании также наблюдалась отчетливая активация цитокинов по сравнению с детьми контрольной группы. Метаанализ, включающий девять исследований COVID-19, показал, что повышение уровня ИЛ-6 у взрослых положительно коррелирует с тяжестью течения коронавирусной инфекции [2, 12]. Тогда как результаты настоящего исследования совпадают с данными M.Z. Hong et al., которые показали, что концентрация и скорость повышения ИЛ-6 у детей ниже, чем у взрослых, что позволяет предположить меньшую интенсивность воспаления, объясняющую преобладание легких форм заболевания [13].

В исследовании, проведенном авторами, продемонстрировано значительное увеличение показателя ТГФ-β1 среди детей с коронавирусной инфекцией по сравнению с группой контроля. Тем не менее в работе H. Karadeniz не обнаружено статистически значимых различий между пациентами с COVID-19 и здоровыми лицами в отношении уровня ТГФ-β1 [14]. Повышение ТГФ-β1 у пациентов с коронавирусной инфекцией, вероятно, связано с поражением легочной ткани, которая обладает способностью продуцировать большое количество ТГФ-β1 при вирусной инфекции. Кроме того, ТГФ-β1 также синтезируется инфильтрированными нейтрофилами, активированными инфекцией SARS-CoV-2.

Ранее сообщалось о высокой концентрации ИЛ-1β при вирусной пневмонии, вызванной коронавирусом 2 типа, у взрослых. В настоящей работе содержание ИЛ-1β при COVID-19 у детей школьного возраста увеличено независимо от степени тяжести, подобные результаты представлены и у других авторов [15]. G. Qian с соавторами сообщили, что сывороточные уровни провоспалительных цитокинов, включая ИЛ-2, ИЛ-4, не отличались между подгруппами детей с пневмонией COVID-19 средней и тяжелой степени тяжести, что согласуется с данными настоящего исследования [16]. Авторы пришли к выводу, что SARS-CoV-2 может не вызывать «цитокинового шторма» у детей, что частично объясняет лучший результат даже при наличии пневмонии [16]. Выводы настоящей работы противоречат заключению Y. Yang, который сообщил о повышенных уровнях ИП-10 в сыворотке при среднетяжелых и тяжелых случаях COVID-19 и о том, что ИП-10 тесно связан с тяжестью заболевания [3]. В соответствии с предыдущим исследованием [17], концентрация ТНФ-α повышена у пациентов с инфекцией, вызванной SARS-CoV-2, по сравнению со здоровыми, но не отличалась среди групп тяжести. В работе, выполненной авторами, уровень ТНФ-α не выходил за рамки контрольных параметров (p > 0,05).

Результаты настоящего исследования о цитокиновом профиле детей школьного возраста при коронавирусной инфекции предоставят дополнительную информацию о патогенезе и помогут клиницистам в оценке и лечении детей с COVID-19 в будущем.

Заключение

Таким образом, у детей школьного возраста при коронавирусной инфекции наблюдается дисбаланс цитокинов за счет увеличения сывороточной концентрации ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИП-10, МСП-1, ИНФ-γ, ТГФ-b1 и снижения уровня ИЛ-10, ИЛ-12p70, ИЛ-17A независимо от степени тяжести COVID-19. Содержание ТНФ-α в сыворотке крови школьников не связано со степенью тяжести COVID-19 и находилось в пределах референтных значений группы контроля. Измерение уровней цитокинов сыворотки крови поможет оценить воспалительный статус пациента, отследить прогрессирование заболевания и стратифицировать пациентов.