В настоящее время дентальная имплантация является наиболее активно развивающимся направлением стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, поскольку частота патологии, требующей комплексной ортопедической реабилитации, остается на высоком уровне и в перспективе не будет иметь тенденции к уменьшению [1].

Дентальная имплантация является оптимальным способом восстановления функции и эстетики зубочелюстной системы, повышения качества жизни пациента [2]. В настоящее время цифровые технологии охватили практически все аспекты стоматологии, в том числе дентальную имплантацию [3, 4].

Предварительное виртуальное планирование ортопедического лечения с применением дентальных имплантатов становится широко востребованным среди стоматологов. Выбор ортопедической конструкции с учетом индивидуальных анатомических параметров, полученных путем совмещения рентгенологических и оптических изображений, позволяет продемонстрировать пациенту результат лечения до его начала, спланировать оптимальное положение имплантатов [5].

В хирургической стоматологии наиболее востребованными являются навигационные хирургические шаблоны, позволяющие сократить время операции и минимизировать послеоперационные осложнения [6].

Как правило, указанный вид изделий медицинского назначения изготавливается методами компьютерного моделирования и производства, а именно посредством аддитивной технологии – 3D-печати.

Однако технологии аддитивного производства в стоматологии все еще нуждаются в исследовании, поскольку остаются нерешенными вопросы об оптимальном конструкционном материале и его постпечатной обработке.

Все конструкционные материалы медицинского назначения должны соответствовать жестким токсикологическим, технологическим, физико-механическим, эстетическим, медико-биологическим требованиям, а в случае с материалами для изготовления навигационных хирургических шаблонов – обладать высокими прочностными характеристиками, не меняющими свои показатели после стерилизации [7, 8, 9].

Однако не все конструкционные материалы для производства хирургических шаблонов допускают стерилизацию готовых изделий с помощью автоклавирования [10]. В хирургической практике не все специалисты подвергают хирургические шаблоны стерилизации перед операцией, а чаще всего ограничиваются дезинфекцией в растворах антисептиков, что не позволяет добиться стерильности используемого инструмента и может привести к послеоперационным осложнениям, связанным с наличием штаммов бактерий, вызывающих гнойно-воспалительные заболевания полости рта [11, 12].

Анализ полученных данных позволит определить степень адгезии микроорганизмов полости рта к поверхности хирургических шаблонов до и после стерилизации, а также сделать вывод о необходимости использования материалов, которые допускают автоклавирование, и строгого соблюдения протокола стерилизации.

Цель исследования

Изучить влияние стерилизации путем автоклавирования при 121°С в течение 30 минут на первичную адгезию микроорганизмов к трем видам конструкционных материалов in vitro.

Материалы и методы исследования

Для достижения поставленной цели были отобраны несколько стоматологических материалов для производства автоклавируемых хирургических шаблонов методом 3D-печати FormLabs Dental SG Resin (Formlabs, США) (материал 1), NextDent SG (NextDent, Нидерланды) (материал 2), HARZLabs Yellow Clear PRO (HARZLabs, Россия) (материал 3).

Полимеры группы 3 (№ РЗН 2020/12007), группы 1 (EN-ISO 10993-1: 2009 / AC: 2010, EN-ISO 20795-1: 2013, EN-ISO 7405: 2009 / A1: 2013) и группы 2 (EN-ISO 10993-1: 2009 / AC: 2010, EN-ISO 20795-1: 2013, EN-ISO 7405: 2009 / A1: 2013) сертифицированы и могут использоваться в медицинских целях.

Исследована адгезивная активность по отношению к предоставленным образцам следующих микроорганизмов:

1) E. coli ATCC 25982;

2) Staphilococcus aureus ATCC 6538;

3) C. albicans NoСТС885-653;

4) Streptococcus mutans – 3003;

5) Streptococcus mitis NCTC 10712;

6) Pseudomonas aeruginosa B-8243.

Этапы проведения исследования

1. Подготовка тест культур к проведению исследования

1.1. 100 мкл тест культур микроорганизмов (E. coli ATCC 25982, Staphilococcus aureus ATCC 6538, C. albicans NoСТС885-653, Streptococcus mutans – 3003, Streptococcus mitis NCTC 10712, Pseudomonas aeruginosa B-8243 вносили в 10 мл питательной среды – сердечно-мозговой бульон: настой мозга теленка, мясной настой (из говядины), протеозопептон, глюкоза, натрия хлорид, натрия гидрофосфат, агар-агар (HIMEDIA® M210, Индия). Время культивирования 24 часа, температура культивирования 37ºC.

1.2. После 24 часов культивирования бульонную культуру центрифугировали 25 минут при 2400 rpm. Бактериальную суспензию для посева и проведения исследования in vitro готовили из микробного осадка по стандарту мутности 0,5 по McFarland (что соответствует 1,5–3,0х108 КОЭ) (McFarland, HIMEDIA), в физиологическом растворе (0,9% NaCl). После этого доводили концентрацию микроорганизмов до 107 микроорганизмов, внося 1 мл стандартизированной бактериальной взвеси к 9 мл сердечно-мозгового бульона. Изготавливали смесь культур в соотношении 1 : 1 : 1 : 1 (по 2,5 мл стандартизированной бульонной взвеси с концентрацией микроорганизмов 107).

2. Выполнение эксперимента

Производилась оценка остаточной адгезии микроорганизмов к трем видам конструкционных материалов стерильных и нестерильных. Эксперимент выполняли с образцами конструкционных материалов (материал 1, материал 2, материал 3). В эксперименте выполнены две серии работ in vitro с использованием стерильных и нестерильных материалов. Учитывая вероятную роль микроорганизмов разных групп в развитии осложнений инфекционно-воспалительной природы после ортопедических операций с применением конструкционных материалов в эксперименте, исследовали чистые тест-культуры бактерий эталонных штаммов: E. coli ATCC 25982 Staphilococcus aureus ATCC 6538, C. albicans NoСТС885-653, Streptococcus mutans – 3003, Streptococcus mitis NCTC 10712, Pseudomonas aeruginosa B-8243. Все образцы являлись штаммами бактерий – потенциальных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний ротовой полости. Для определения остаточной адгезии использовали стандартную методику [13].

Образцы конструкционных материалов (материал 1 – FROMLABS SG, материал 2 – NEXTDENT, материал 3 – HARZLABS) помещали в чашку Петри с 10 мл взвеси культуры микроорганизмов концентрацией 107 CFU / ml (КОЕ / мл, на основе 0,9% NaCl). Экспозиция составила 40 минут при температуре 37oC, время и температура культивирования выбраны с учетом создания условий жизнеобеспечения тестируемых микроорганизмов.

Бактериальные клетки, которые не вступили в процесс адгезии, удаляли с помощью ультразвуковых воздействий в аппарате Ultrа-Est («Геософт», Россия) в 0,9% NaCl в течение 5 мин (частота ультразвуковых воздействий 40 кГц, мощность 240 Вт) для удаления не адгезированных на поверхности конструкционных материалов клеток.

Образцы с микробными клетками, вступившими в процесс адгезии, трижды с каждой стороны прикладывали к поверхности питательной среды (формировали отпечатки), что позволяло микробным клеткам оставаться на поверхности питательной среды, давать рост изолированных колоний, а исследователям – определять остаточную адгезию.

Культивировали полученные отпечатки в течение 24 часов при температуре 37oC с учетом физиологических особенностей тестируемых микроорганизмов. По окончании инкубации производили подсчет колоний.

Индекс остаточной адгезии рассчитывали и переводили в процентный показатель [13] по формуле: Iао=lgA/lgN·100%, где Iао – индекс остаточной адгезии; lgA – число адгезированных бактерий, выраженных через десятичный логарифм (КОЕ/мл); lgN – количество бактерий исходной взвеси, наносимой на стандартный образец, выраженное через десятичный логарифм (КОЕ/мл) [14].

Для проведения статистических исследований применяли пакет прикладных программ «Statistica 12.5». Для оценки на нормальность выборки использовали критерий Shapiro–Wilk's W test с дальнейшим применением критерия Манна–Уитни с принятым уровнем значимости р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

При исследовании адгезии к композитным материалам (материал 1 – FROMLABS SG, материал 2 – NEXTDENT, материал 3 – HARZLABS) штаммов бактерий E. coli ATCC 25982 Staphilococcus aureus ATCC 6538, C. albicans NoСТС885-653, Streptococcus mutans – 3003, Streptococcus mitis NCTC 10712, Pseudomonas aeruginosa B-8243 установлено, что в контрольной серии экспериментов (образцы без стерилизации) индексы остаточной адгезии находились на высоком уровне, р<0,05 (табл. 1).

Таблица 1

Остаточная адгезия штаммов бактерий E. coli ATCC 25982 Staphilococcus aureus ATCC 6538, C. albicans NoСТС885-653, Streptococcus mutans – 3003, Streptococcus mitis NCTC 10712, Pseudomonas aeruginosa B-8243 к трем видам конструкционных материалов стерильных (материал 1 – FROMLABS SG, материал 2 – NEXTDENT, материал 3 – HARZLABS) в течение срока стерилизации

Примечание. * — статистически значимые различия между сравниваемыми сериями образцов трех конструкционных материалов стерильных и нестерильных (р<0,05), р 1-2 без ст – сравнение по показателям конструкционный материал 1-2 без ст, р 1-3 – сравнение по показателям конструкционный материал 1-3 без стерилизации, р 1-2 без ст- р1-2 ст≥0,05, р 1-3 без ст- р1-3 ст≥0,0

Все штаммы изучаемых бактерий из нанесенной на образцы бактериальной взвеси вступали в процесс адгезии и хорошо прилипали к образцам трех композитных материалов. При изучении образцов после стерилизации 121°С 30 минут выявлено, что процентные показатели остаточной адгезии были достоверно ниже, приближаясь к нулевым показателям, при этом просматривается статистическая значимость по адгезии микроорганизмов к конструкционным материалам: максимальная адгезия после стерилизации к материалу 2 – NEXTDENT, минимальная адгезия к материалу 3 – HARZLABS. Таким образом, процесс стерилизации материалов 121°С 30 минут дает основания говорить о достоверном снижении адгезии микроорганизмов к композитным материалам.

Поскольку исследования показали важность стерилизации при режиме 121°С 30 минут, то представлялось интересным проследить динамику изменений через 24 часа и 10 суток после окончания стерилизации.

Через 24 часа после окончания срока стерилизации процентные показатели остаточной адгезии также были достоверно ниже, чем в контроле, и была выявлена статистически значимая разница между материалами: максимальная адгезия зарегистрирована к материалу 2 – NEXTDENT, разницы по адгезии к материалам 1 – FROMLABS SG и материалу 3 – HARZLABS не выявлено (р>0,05) (табл. 2)

Таблица 2

Остаточная адгезия штаммов бактерий E. coli ATCC 25982 Staphilococcus aureus ATCC 6538, C. albicans NoСТС885-653, Streptococcus mutans – 3003, Streptococcus mitis NCTC 10712, Pseudomonas aeruginosa B-8243 к трем видам конструкционных материалов стерильных (1 – FROMLABS SG, 2 – NEXTDENT, 3 – HARZLABS), 24 часа после окончания срока стерилизации

Примечание. * – статистически значимые различия между сравниваемыми сериями образцов трех конструкционных материалов стерильных и не стерильных (р<0,05), р 1-2 без ст – сравнение по показателям конструкционный материал 1-2 без ст, р 1-3 – сравнение по показателям конструкционный материал 1-3 без стерилизации, р 1-2 без ст- р1-2 ст≥0,05, р 1-3 без ст- р1-3 ст≥0,05

Через 10 суток после стерилизации не выявлено различий между содержанием микроорганизмов до стерилизации и через 10 дней после нее, что свидетельствует о значимости срока в 10 дней для оценки уровня остаточной адгезии (табл. 3)

Таблица 3

Остаточная адгезия штаммов бактерий E. coli ATCC 25982 Staphilococcus aureus ATCC 6538, C. albicans NoСТС885-653, Streptococcus mutans – 3003, Streptococcus mitis NCTC 10712, Pseudomonas aeruginosa B-8243 к трем видам конструкционных материалов стерильных (материал 1 – FROMLABS SG, материал 2 – NEXTDENT, материал 3 – HARZLABS), 10 суток после стерилизации

Примечание. * – статистически значимые различия между сравниваемыми сериями образцов трех конструкционных материалов стерильных и не стерильных (р<0,05), р 1-2 без ст – сравнение по показателям конструкционный материал 1-2 без ст, р 1-3 – сравнение по показателям конструкционный материал 1-3 без стерилизации, р 1-2 без ст- р1-2 ст≥0,05, р 1-3 без ст- р1-3 ст≥0,05

Заключение

В течение срока стерилизации в режиме 121°С 30 минут остаточная адгезия на материалах 1 – FROMLABS SG и материале 3 – HARZLABS не выявлена, различий по группам сравнения не установлено (р>0,05).

После стерилизации через 24 часа после окончания срока S. aureus на образце 1 характеризовался высоким уровнем адгезии до стерилизации и в 5,1 раза более низким после (60,76±3,09 и 12,12±2,17% соответственно различия статистически значимы) р<0,05, на образце 2 (61,02±4,1 и 12,98±1,27%) различия статистически значимы) р<0,05. на образце 3 (59,91±3,00 и 13,00±2,00%). (C. albicans СТС885-653 характеризовался высоким уровнем адгезии на образцах без стерилизации, и достоверно более низким после стерилизации у всех трех материалов. р<0,05. S. mutans – 3003 характеризовался высоким уровнем адгезии на образцах без стерилизации и достоверно более низким после стерилизации у всех трех материалов, различия статистически значимы, р<0,05. S. mitis NCTC 10712 характеризовался высоким уровнем адгезии на образцах без стерилизации и достоверно более низким после стерилизации у всех трех материалов, различия статистически значимы, р<0,05. Наиболее высокий уровень остаточной адгезии до стерилизации установлен у S. aureus и С. albicans, S. mutans – 3003, Streptococcus mitis NCTC 10712. Таким образом, различия индексов остаточной адгезии используемых эталонных штаммов до и после стерилизации были статистически значимы, что позволяет судить о влиянии стерилизации в режиме 121°С 30 минут на адгезию анализируемых микроорганизмов (табл. 2).

S. aureus характеризовался высоким уровнем адгезии на образцах как без стерилизации, так и через 10 дней после стерилизации (61,56±3,95 и 55,87±2,95% соответственно, различия статистически не значимы, р≥0,05). C. albicans NoСТС885-653 характеризовались высоким уровнем адгезии на образцах как без стерилизации, так и спустя 10 дней после стерилизации (52,48±3,60 и 52,08±3,00%, различия статистически не значимы, р≥0,05). S. mutans – 3003 характеризовался высоким уровнем адгезии на образцах как без стерилизации, так и после стерилизации (69,41±6,42 и 60,4±5,38 соответственно, различия статистически не значимы, р≥0,05). S. mitis NCTC 10712 характеризовался высоким уровнем адгезии на образцах как без стерилизации, так и через 10 дней после стерилизации (61,65±4,89 и 57,51±3,54 соответственно, различия статистически не значимы, р≥0,05). Наиболее высокий уровень адгезии установлен у S. aureus и С. albicans, S. mutans – 3003 Streptococcus mitis NCTC 10712. Таким образом, все различия индексов остаточной адгезии используемых эталонных штаммов до и после стерилизации имели лишь тенденцию к отличию до и через 10 дней после стерилизации.

Проведенное исследование доказывает необходимость стерилизации хирургических шаблонов для дентальной имплантации и использования не позднее чем через 24 часа после стерилизации путем автоклавирования.