Введение. Туберкулез (ТБ) является серьезной глобальной проблемой здравоохранения. По данным ВОЗ, в год в мире регистрируется 9 миллионов новых случаев туберкулеза, из них 2 миллиона - смертельные случаи [1, с. 9-10]. Появление штаммов микобактерий туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью является еще одним вызовом человечеству. Наиболее распространенным лекарственным средством, применяемым против туберкулеза, является изониазид [2]. Этот метод лечения приводит ко многим метаболическим и морфологическим нарушениям в печени, поскольку печень является основным органом детоксикации для этого противотуберкулезного препарата. Применение изониазида в течение 9 месяцев вызывает серьезные побочные эффекты в организме, включая аллергические реакции, желудочно-кишечные расстройства, неврологические расстройства, головокружение, а наиболее серьезным из них является гепатит. Этот процесс характеризуется снижением концентрации сывороточного альбумина и повышением концентрации сывороточного глобулина [3]. Эти эффекты связаны с тяжестью и продолжительностью заболевания. Было показано, что перекисное окисление эндогенных липидов (ПОЛ) является основным фактором цитотоксического действия изониазида. Окислительное повреждение, опосредованное противотуберкулезными препаратами, обычно связывают с образованием высокореактивного кислорода, который действует как стимулятор ПОЛ и источник разрушения и повреждения клеточных мембран [4; 5]. В связи с вышеизложенным создание новых лекарственных форм изониазида с пролонгирующим действием на очаги туберкулезного возбудителя, снижающих тем самым его гепатотоксическое действие, представляется актуальным.

Для улучшения биофармацевтических свойств производных изоникоти­новой кислоты предложено несколько путей.

Ряд авторов предлагает пролонгировать действие изониазида в лекарственных формах, создавая их на основе сополимеров. При этом срок нахождения изониазида в организме увеличивается в 1,0-2,0 раза [6, с. 464-465].

В Пятигорском медико-фармацевтическом институте группой ученых получены соединения – включения изониазида с циклодекстрином. Исследования противотуберкулезной активности показали, что активность изониазида в соединении - включении сохраняется. В то же время острая токсичность снижается в 1,4 раза [7]. Кроме циклодекстринов, в мировой практике для создания лекарственных форм препаратов используют и другие полисахариды.

Для улучшения биофармацевтических свойств изониазида авторами предложена его лекарственная форма на основе сочетания с полисахаридами – гранулы изониазида с пектином свекловичным и сахарозой в соотношении 1:6:1. Установлено, что гранулы изониазида с пектином характеризуются пониженной токсичностью, снижением элиминации, повышением биодоступности и пролонгированным действием [8].

Пектиновые вещества проявляют антимикробные свойства, не оказывают отрицательного действия на восстановление белкового состава крови. 1%-ный раствор пектина не обладает токсическим и антигенным свойством, он не кумулируется в органах и тканях и не вызывает патологических изменений [9, с. 160].

Цель исследования: оценка эффективности корригирующего действия гранул изониазида с пектином на антиоксидантную систему печени и сравнение их антимикобактериального действия с изониазидом в стандартной лекарственной форме.

Материалы и методы исследования

Антиоксидантную активность предложенной лекарственной формы гранул изониазида с пектином свекловичным определяли в эксперименте на белых беспородных крысах массой 180-200 г, находившихся в стандартных условиях вивария. Показателями оценки интенсивности ПОЛ служили методики определения ТБК-активных продуктов в гомогенате печени и крови и диеновые конъюгаты (ДК) в печени, выполненные по стандартным методикам.

Сравнительную оценку антимикобактериального действия изониазида и его лекарственной формы – гранул изониазида с пектином - проводили методом серийных разведений в среде МБТ-бульон с последующим пересевом на среду Левенштейна-Йенсена [10, с. 10-12]. В качестве тест-культур (10 штаммов) были использованы клинические изоляты M. tuberculosis, выделенные от больных, находящихся на стационарном лечении в ГБУЗ СК «Пятигорский межрайонный медицинский фтизиопульмонологический центр». Все культуры поддерживались на среде Левенштейна-Йенсена (ТУ 9385-021-39484474-2012; ООО «НИЦФ», Санкт-Петербург, Россия); МБТ-бульон (ТУ 9385-26-14237183-2009; ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России, Махачкала).

Использованный в эксперименте метод серийных разведений заключался в создании ряда последовательных разведений исследуемых гранул изониазида с пектином и чистого изониазида, использованного в опыте в качестве контроля. В среде МБТ-бульон готовили ряд разведений: 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1 мкг/мл. Пробирка, содержащая среду МБТ-бульон и культуру для оценки жизнеспособности микобактерий, и пробирка только со средой для оценки стерильности использованной среды (контроли).

Разведения лекарственной формы гранул изониазида с пектином готовили таким образом, чтобы концентрации изониазида в гранулах соответствовали кон­центрациям чистого изониазида. Навеску изониазида (6,4 мг) и гранул изониазида с пектином (44,8 мг) растворяли в 50 мл воды очищенной с несколькими каплями соляной кислоты 0,1 М до растворения. Получали рабочий раствор с концентрацией 128 мкг/мл, из которого готовили разведения согласно методике.

Все работы проводили в боксе с соблюдением санитарно-эпидемиологических правил работы с микроорганизмами III-IV группы патогенности [11; 12].

Взвесь M. tuberculosis готовили из 4-недельных культур, выращенных на скошенной плотной питательной среде Левенштейна – Йенсена. Снимали петлей колонию микобактерий, затем поме­щали в стеклянную пробирку, растирали стеклянной палочкой в течение 4-5 минут и добавляли стерильный физиологический раствор. Суспензию культуры стандартизировали по стандарту мутности McFarland 5, что соответствует 15*108 микроб­ных тел в 1 мл. Затем в каждую пробирку, кроме пробирки с контролем чистоты среды, добавляли по 0,2 мл взвеси микроорганизмов. Посевы помещали в термостат при температуре 37℃ на 10-14 дней. По прошествии этого срока пробирки доставали и визуально оценивали наличие роста. В контрольной пробирке ожидался придонный рост с диффузным помутнением бульона. Минимальной подавляющей концентрацией (МПК) считали ту пробирку в ряду, в которой визуально не наблюдалось роста культуры. После этого пробирки центрифугировали (1500 об. мин./10 мин.), удаляли надосадочную жидкость, отмывали стерильным физиологическим раствором осадок и высевали на среду Левенштейна-Йенсена по 0,05 мл в каждую пробирку. Посевы инкубировали 10 дней при температуре 37℃, после чего оценивали наличие и интенсивность роста колоний. Концентрация в ряду разведений, в которой не обнаруживалось роста, считалась минимальной бактерицидной концентрацией (МБК), а минимальной подавляющей концентрацией (МПК) - та, при которой наблюдалось задержка роста на 50% относительно контроля. Каждый высев осуществляли не менее чем в шести повторностях. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программы BioStat-2009 (Analist Soft Ins., США).

Результаты исследования и их обсуждение

Ранее проведенными исследованиями применения изониазида в сравнении с лекарственной формой гранул изониазида с пектином было установлено, что применение изониазида в дозе 200 мг/кг сопровождается повышением АлАТ, ЩФ, общего холестерина в крови при одновременном снижении содержания гликогена и общих липидов в печени. При применении лекарственной формы изониазида с пектином в эквивалентной дозе показатели нормализовались.

При сравнительном введении изониазида и его лекарственной формы гранул изониазида с пектином группам крыс было показано, что у крыс, получавших изониазид в дозе 200 мг/кг, наблюдалось снижение ТБК-активных продуктов и ДК в печени на 68% и 50% соответственно, а содержание ТБК-активных продуктов в сыворотке повысилось на 104%. У крыс, получавших гранулы изониазида с пектином, наблюдалось незначительное снижение ТБК-активных продуктов и ДК в печени - на 27% и 32% соответственно по сравнению с нормой, а содержание ТБК-активных продуктов в сыворотке понизилось на 40% по отношению к контрольной группе животных. Данные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Влияние введения изониазида и комбинации изониазид+пектин на продукты ПОЛ

Примечание: Ри – достоверно по отношению к интактным (контрольным) животным; Рк – достоверно по отношению к животным, получавших изониазид.

Визуальная оценка роста микобактерий на среде МБТ-бульон под действием изониазида показала, что исследуемое соединение активно подавляло рост микобактерий. Для штаммов 1, 4, 10 минимальная бактерицидная концентрация (МБК) была определена в концентрациях 128-64 мкг/мл, для остальных штаммов - в диапазоне концентраций 128-32 мкг/мл. Под действием этих концентраций помутнение и придонный рост отсутствовали полностью. При снижении концентрации изониазида в пробирках появлялся сначала слабый (16-4 мкг/мл), затем интенсивный рост (2-1 мкг/мл), сопоставимый с контролем. Визуальная оценка активности в отношении микобактерий туберкулеза гранул изониазида с пектином в целом не отличалась от действия свободного изониазида. Только в некоторых случаях, для штаммов 1 и 8, наблюдался достаточно интенсивный рост при концентрации 16 мкг/мл, что в целом не искажает данные, а, по-видимому, является особенностью этих штаммов (табл. 2, 3).

Таблица 2

Визуальная оценка активности изониазида в отношении M. tuberculosis на среде МБТ-бульон

Примечание: «–» - полная прозрачность среды; «+» - слабый рост; «++» - умеренный рост; «+++» - интенсивный рост.

Таблица 3

Визуальная оценка активности гранул изониазида с пектином в отношении M. tuberculosis на среде МБТ-бульон

Примечание: «–» - полная прозрачность среды; «+» - слабый рост; «++» - умеренный рост; «+++» - интенсивный рост.

Далее была проведена оценка наличия и интенсивности роста  M. tuberculosis на среде Левенштейна-Йенсена. Результаты, приведенные в таблицах 4 и 5, наглядно демонстрируют, что как изониазид, так и гранулы изониазида с пектином оказывают идентичное противотуберкулезное действие. Минимальная бактерицидная концентрация изучаемых субстанций находилась в диапазоне 128-32 мкг/мл для всех тест-культур. Штаммы 1 и 10 демонстрировали незначительный рост атипичных колоний при применении концентрации 32 мкг/мл, что, по-видимому, связано с их устойчивостью к изониазиду в целом. Как было отмечено ранее, МПК считалась та, при которой отмечалась задержка роста на 50% и более относительно контроля. Минимальной подавляющей концентрацией в эксперименте можно считать диапазон концентраций от 16 до 4 мкг/мл. Снижение концентрации субстанций приводило к появлению многочисленных атипичных, а в некоторых случаях (при концентрации 1 мкг/мл) типичных колоний микобактерий туберкулеза.

Таблица 4

Оценка активности изониазида в отношении M. tuberculosis на среде Левенштейна-Йенсена

Таблица 5

Оценка активности гранул изониазида с пектином в отношении M. tuberculosis на среде Левенштейна-Йенсена

Заключение. Таким образом, исходя из данных при сравнительном изучении применения изониазида и его лекарственной формы в виде гранул с пектином, можно сделать вывод, что гранулы изониазида с пектином обладают менее повреждающим воздействием на гепатоциты с сохранением защитных антиоксидантных механизмов.

На основании полученных результатов сравнительных исследований стандартной лекарственной формы изониазида и гранул изониазида с пектином можно заключить, что минимальные бактерицидные концентрации и минимальные подавляющие концентрации изученных субстанций, и в целом их эффективность в отношении всех использованных в эксперименте тест-культур, не отличались друг от друга.