Введение

Интоксикация организма при травмах, сопровождающихся нарушением целостности тканей и органов, лежит в основе патогенетических механизмов, приводящих к полиорганной недостаточности [1, 2]. Одним из накапливаемых в организме при таких состояниях метаболитов является лактат. Развивающийся лактатацидоз оказывает негативное влияние на функцию мышц [3, 4]. При этом могут изменяться функции и других органов и систем [5, 6]. В совокупности такие системные нарушения становятся фактором, усугубляющим течение посттравматического периода у целевых пациентов [7, 8]. Поэтому возникающая в посттравматическом периоде гиперлактатемия требует мониторинга и соответствующей патогенетической коррекции [9, 10]. В этом плане важным фактором для разработки стратегий купирования лактатацидоза может стать выявление роли мышц различных типов в генерации лактата в посттравматическом периоде [11, 12]. Данные аспекты с фундаментальных позиций изучены неполно, что обусловило цель данной работы.

Цель исследования – изучить особенности накопления лактата в скелетных мышцах разного типа после их повреждения на модели сдавливания у крыс.

Материал и методы исследования

Исследование выполнено на 36 взрослых крысах-самцах линии Вистар массой 380–400 г. Всем животным моделировали травматическое повреждение конечности путем сдавливания мягких тканей в верхней трети правой голени корнцангом в течение 60 секунд [13]. Процедуру выполняли в условиях операционной, под общим наркозом, адаптированным по массе тела (рометар 2% – 1 мг/кг; золетил 100 – 10 мг/кг). После оперативного вмешательства животных помещали в клетки по две особи. В качестве послеоперационной анальгезии использовали метамизол натрия подкожно в дозе 30 мг/кг, 2 раза в день в течение 3 суток. Уход за животными в посттравматическом периоде осуществляли ежедневно. Животные содержались на стандартном сбалансированном рационе при свободном доступе к воде.

Эвтаназию выполняли путем декапитации после предварительной премедикации (рометар 2% – 1 мг/кг; золетил 100 – 10 мг/кг) через 7, 14, 21, 28 и 90 суток после травмы. В каждый срок выводили из опыта по 6 животных. Контрольную группу составили 6 интактных крыс аналогичной массы тела. У всех животных после эвтаназии осуществляли забор передней большеберцовой (ПББМ) и камбаловидной мышц (КМ) травмированного сегмента конечности, в процессе вывода из опыта собирали кровь. Выбор указанных мышц обусловлен тем, что ПББМ относят к мышцам с преобладанием гликолитических (быстрых) волокон, КМ – с преобладанием волокон окислительного (медленного) типа [14, 15].

После забора материала один фрагмент каждой мышцы отмывали от эритроцитов в охлажденном 0,03М растворе КСl. Взвешенную измельченную ткань растирали в 0,03М растворе КСl при 5°С до получения гомогената. Затем гомогенат центрифугировали 15 мин при 14000g на ультрацентрифуге «Beckman&Coulter» (США). В одной аликвоте полученного надосадка определяли активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и ее изоферментный спектр, определяли концентрацию лактата и глюкозы. В другой аликвоте надосадка определяли скорость образования лактата при добавлении в полученный экстракт раствора глюкозы. Соотношение реагентов: 0,5мл мышечного экстракта и 0,25мл 0,03М раствора глюкозы на 0,05М калий-фосфатном буфере. Время инкубации – 60 минут при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 1,5мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Для определения исходных концентраций субстрата параллельно ставили контрольную пробу, в которую ТХУ приливали к инкубационной смеси перед добавлением субстратов. После этого в депротеинизированном субстрате определяли концентрацию лактата и по разнице с контрольной пробой рассчитывали прибыль или убыль лактата. В навеске другого фрагмента каждой мышцы определяли содержание гликогена непрямым антроновым методом. В сыворотке крови определяли концентрацию глюкозы и лактата.

Активность ЛДГ, а также концентрацию лактата и глюкозы определяли на автоматическом биохимическом анализаторе Hitachi/BM 902 (Япония), используя наборы реагентов фирмы Vital Diagnostics (Россия). Активность ЛДГ рассчитывали в единицах активности (Е) на 1 г белка, который в экстракте определяли по методу Лоури. Концентрацию лактата, глюкозы и гликогена в мышечном экстракте выражали в молях на 1 г сырой ткани. Электрофоретическое разделение ЛДГ проводили на системе Paragon (Beckman&Coulter) с использованием реактивов и пластин этой же фирмы.

Статистическую обработку вариационных рядов проводили непараметрическими методами. Нормальность распределения в выборках оценивали по критерию Шапиро–Уилка. Результаты в таблицах представлены в виде медианы, 1–3-го квартиля (Me, Q1-Q3). Статистическую значимость различий показателей оценивали с применением Т[C1]-критерия Манна–Уитни. Минимальный уровень значимости (р) принимали равным 0,05 и менее. Статистическую обработку данных выполняли в программе AtteStat версия 9.3.1.

До начала исследования было получено одобрение локального этического комитета (протокол №2(75) от 23.10.2023 г.). Исследование проведено при соблюдении принципов гуманного обращения с лабораторными животными в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей, и Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.

Результаты исследования и их обсуждение

Обнаружено, что уровень лактата в ПББМ интактных животных был статистически значимо выше, чем в КМ, в среднем в 2,4 раза (р=0,01) (табл. 1). В посттравматическом периоде динамика уровня лактата в данных мышцах имела существенные различия. Так, в ПББМ концентрация лактата была существенно выше средних значений интактных животных лишь однажды – на 21-е сутки после травмы, когда уровень лактата относительно интактных животных был выше на 26% (р=0,05). В свою очередь, содержание лактата в КМ на всех сроках наблюдения после травмы значимо превышало значения интактных животных. Максимум накопления лактата в КМ приходился на 21-е сутки после травмы, превышая уровень интактных животных в среднем на 191% (р=0,001). Наблюдаемый рост образования лактата в скелетных мышцах травмированного сегмента сопровождался статистически значимым увеличением концентрации лактата в сыворотке крови, которое наблюдалось в период с 21-х по 90-е сутки посттравматического периода. Максимум гиперлактатемии приходился на 21-е сутки эксперимента (на этом же сроке максимум накопления лактата отмечен и в обеих исследуемых мышцах), уровень лактата крови на этом сроке был достоверно выше значений интактных животных – на 27% (р=0,01).

Примечания: таблица 1 составлена авторами по результатам данного исследования; ПББМ – передняя большеберцовая мышца, КМ – камбаловидная мышца; Верхний индекс – уровень значимости различий (р) по сравнению с мышцей интактных животных. * – значимость различий с ПББМ интактных животных при р=0,01.

Примечания: таблица 2 составлена авторами по результатам данного исследования; ПББМ – передняя большеберцовая мышца, КМ – камбаловидная мышца; Верхний индекс – уровень значимости различий (р) по сравнению с мышцей интактных животных. * – значимость различий с ПББМ интактных животных при р=0,01.

Наблюдаемое существенное нарастание уровня лактата в КМ в посттравматическом периоде, вероятно, было связано с изменением активности ЛДГ, которая в КМ была достоверно снижена относительно значений интактных животных на 7-е и 14-е сутки после травмы (табл. 2). Такое снижение активности ЛДГ тормозило превращение лактата в пируват и вызывало накопление лактата. Это связано с особенностями изоферментного профиля ЛДГ в КМ, в котором повышено относительно ПББМ содержание Н-субъединиц, катализирующих именно превращение лактата в пируват (табл. 3). Поэтому после нарушения целостности мышц возможности распада лактата в КМ оказались снижены, вероятно, за счет большей чувствительности данной мышцы (как мышцы с преобладанием окислительных мышечных волокон) к недостатку кислорода. Отмеченные выше в КМ закономерности, очевидно, не наблюдались в ПББМ, в которой как в мышце с преобладающей гликолитической активностью лактатдегидрогеназная ферментная система в условиях посттравматического повреждения была более устойчива к анаэробным условиям (в изоферментном спектре ЛДГ существенно преобладают М-субъединицы).

Примечания: таблица 3 составлена авторами по результатам данного исследования; ПББМ – передняя большеберцовая мышца, КМ – камбаловидная мышца. Верхний индекс – уровень значимости различий (р) по сравнению с ПББМ интактных животных.

Содержание гликогена в ПББМ интактных животных было достоверно выше, чем в КМ, в среднем на 28% (р=0,01) (табл. 2). В посттравматический период уровень гликогена в ПББМ был значимо ниже значений интактных животных на 7-и и 14-е сутки после травмы, в среднем на 10% (р=0,04). В КМ уровень гликогена на 14-е сутки после травмы был в среднем снижен на 13% относительно значений интактных животных (р=0,05).

Примечания: таблица 4 составлена авторами по результатам данного исследования; ПББМ – передняя большеберцовая мышца, КМ – камбаловидная мышца; Верхний индекс – уровень значимости различий (р) по сравнению с мышцей интактных животных.

Концентрация глюкозы в ПБММ относительно животных интактной группы на сроках наблюдения достоверно не отличалась (табл. 4). Уровень глюкозы в КМ на 14-е сутки после травмы был достоверно выше относительно животных интактной группы на 12% (р=0,05). Концентрация глюкозы в сыворотке крови животных опытной группы на 7-е сутки после травмы была достоверно выше значений животных интактной группы на 23% (р=0,02).

Полученные данные демонстрируют, что в посттравматическом периоде наиболее существенные изменения в генерации лактата наблюдались в КМ. В течение первых 3 недель после травмы в данной мышце значительно (почти в 3 раза) увеличивалось содержание лактата. При этом такое накопление лактата в КМ сопровождалось изменениями уровня субстратов гликолиза (глюкозы и гликогена): происходили снижение внутримышечных резервов гликогена в течение первых 3 недель посттравматического периода и рост уровня глюкозы на 14-е сутки после травмы. Наблюдаемый рост лактата и динамику изменения субстратов гликолиза можно связать со снижением активности ЛДГ в КМ, что, за счет преобладания в изоферментном спектре ЛДГ Н-субъединиц (катализируют переход лактата в пируват), приводило к снижению утилизации лактата через данный лактатдегидрогеназный механизм. Это в совокупности с нарушением кровоснабжения, а значит, и снижением оксигенации мышцы, приводило к существенному росту генерации лактата именно в КМ как мышце с преобладанием окислительных мышечных волокон, а значит, более чувствительной к недостатку кислорода.

При этом, однако, обнаружено, что, несмотря на значительное нарастание лактата в КМ в первые 2 недели после травмы, резервы для его утилизации по лактатдегидрогеназному пути в КМ были существенны. В частности, об этом говорят данные скорости убывания лактата в бесклеточном мышечном экстракте (табл. 5).

Примечания: таблица 5 составлена авторами по результатам данного исследования; ПББМ – передняя большеберцовая мышца, КМ – камбаловидная мышца; Верхний индекс – уровень значимости различий (р) по сравнению с мышцей интактных животных.

Так, в экстракте из КМ на 7–14-е сутки после травмы отмечалось достоверное относительно КМ интактных животных увеличение скорости утилизации лактата при добавлении в среду глюкозы, то есть введение дополнительного количества глюкозы не вызывало накопления лактата. Это наблюдение позволяет говорить, что, помимо недостатка кислорода, важным фактором для торможения утилизации лактата в КМ в эти сроки является низкая доступность субстратов гликолиза – глюкозы и в определенной степени гликогена. Сохранение высокого уровня лактата в КМ на сроках 28–90-е сутки посттравматического периода, вероятно, обеспечивало наблюдаемую в этот период длительную гиперлактатемию.

В отличие от изменений, отмеченных в КМ, процессы генерации лактата в ПБММ были менее значительны. Вклад мышц с преобладающими гликолитическими волокнами в развитие гиперлактатемии в посттравматическом периоде, видимо, был несущественен, хотя и здесь отмечался рост лактата на 21-е сутки после травмы. Такая особенность ПББМ, вероятно, вызвана большей устойчивостью мышц данного типа к анаэробным условиям.

Заключение

Основным источником гиперлактатемии в посттравматический период после повреждения мягких тканей являются скелетные мышцы травмированного сегмента. При этом наибольший вклад в генерацию лактата вносят мышцы с преобладающим числом окислительных мышечных волокон, в частности камбаловидная мышца. Эти данные свидетельствуют о том, что стратегии купирования лактатацидоза в посттравматическом периоде после сдавливания скелетных мышц должны подразумевать восстановление оксигенации и повышение доступности глюкозы, прежде всего, для мышц с преимущественным преобладанием окислительных волокон, особенно в ранний посттравматический период.