Введение

Бензоат натрия (Е211) и тартразин (Е102) - один из самых распространенных консервантов и синтетический азокраситель, поступление которых с пищей носит длительный и практически повсеместный характер [1]. Допустимая суточная доза (ДСД) бензойной кислоты и ее солей, установленная Объединенным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам (JECFA), в 2021 г. увеличена с 0–5 до 0–20 мг/кг массы тела в пересчете на бензойную кислоту [2]; ДСД тартразина в 2016 г. повышена с 0–7,5 до 0–10 мг/кг [3]. В эксперименте бензоат натрия нарушает у мышей память и координацию движений и вызывает оксидативный стресс в головном мозге [4]; у крыс при 28-суточном введении он повышает содержание продуктов перекисного окисления липидов, фактора некроза опухоли α и активность каспазы-3 в стриатуме, гиппокампе, лобной коре и мозжечке [5]. Тартразин приводит к дегенеративным изменениям нейронов и реактивному астроглиозу в мозжечке [6; 7], а его нейротоксичность связывают с окислительным повреждением и апоптозом [8].

Травма опорно-двигательного аппарата сопровождается системной воспалительной реакцией, запускающей репаративный остеогенез [9]. На моделях перелома большеберцовой кости у грызунов показаны активация микроглии и астроцитов, повышение содержания провоспалительных цитокинов и утрата синапсов в головном мозге [10; 11]. Двунаправленная связь центральной нервной системы и скелета в настоящее время рассматривается в рамках концепции оси «мозг - кость» [12]. Ранее авторами установлено, что дефект большеберцовой кости сам по себе вызывает изменения структуры коры мозжечка крыс [13], а также описаны различия ультраструктуры крупных и малых нейронов латерального (зубчатого) ядра мозжечка [14], которые могут по-разному реагировать на повреждающие воздействия. Вместе с тем остается неясным, как предшествующее длительное введение пищевых добавок изменяет ответ мозжечка на костную травму и взаимодействуют ли эффекты двух факторов.

Цель исследования

Оценить морфометрические изменения коры и зубчатого ядра мозжечка крыс в динамике после нанесения дефекта большеберцовой кости на фоне предшествующего 60-суточного введения бензоата натрия и тартразина в двух дозах.

Материал и методы исследования

Исследование выполнено на 350 белых беспородных крысах-самцах репродуктивного возраста с исходной массой тела 200±10 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария (пластиковые клетки, температура 20–22 °С, влажность 40–45%) со свободным доступом к гранулированному корму и воде. Работу проводили в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. о защите животных, используемых в научных целях; протокол исследования одобрен Комиссией по биоэтике Луганского государственного медицинского университета им. Святителя Луки (протокол № 2 от 25.03.2022).

В рамках единого эксперимента животные были распределены на 10 групп по 35 особей (по 7 на каждый из пяти сроков наблюдения). Распределение животных по группам и срокам выведения из эксперимента проводили случайным образом. Обозначения групп: К - контрольная группа; К+Д - группа изолированного дефекта; Б - бензоат натрия, Т - тартразин, число после буквы - доза в мг/кг массы тела; «+Д» - нанесение дефекта после курса введения добавки. В статье анализируются группы с нанесением дефекта и контрольная группа (К, К+Д, Б500+Д, Б1000+Д, Т750+Д, Т1500+Д; 210 животных). Четыре группы, получавшие те же добавки без нанесения дефекта (Б500, Б1000, Т750, Т1500; 140 животных), выводили из эксперимента в те же сроки; их данные использованы для прямого сопоставления с сочетанными группами и для двухфакторного дисперсионного анализа. Результаты по коре мозжечка в группах Б500 и Б1000 частично опубликованы ранее [15; 16]; данные групп Т750 и Т1500, а также данные по зубчатому ядру во всех группах без дефекта приведены в дополнительных материалах к статье.

Животные групп К и К+Д ежедневно (с 7:00 до 10:00) внутрижелудочно через зонд получали 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида, остальных групп - в том же объеме раствор бензоата натрия (Eastman Chemical B.V., Нидерланды) в дозе 500 или 1000 мг/кг либо тартразина (ROHA Dyechem Pvt. Ltd., Индия) в дозе 750 или 1500 мг/кг массы тела в течение 60 суток; дозу рассчитывали ежедневно по результатам взвешивания. Продолжительность введения превышает стандартный 28-суточный тест с повторным введением и была выбрана для оценки последствий длительного (субхронического) поступления добавок.

Дозы планировали в 2022 г. как 100- и 200-кратные значения ДСД для человека, принятые в качестве референтных: 5 мг/кг для бензоата натрия (групповая ДСД бензойной кислоты и ее солей, установленная JECFA в 1996 г. [17]) и 7,5 мг/кг для тартразина (ДСД JECFA, действовавшая до 2016 г. [3]). Эти значения установлены для человека; межвидовой пересчет доз при планировании не выполняли, поэтому кратность ДСД носит условный характер. Относительно действующих ДСД (20 мг/кг в пересчете на бензойную кислоту и 10 мг/кг [2; 3]) использованные дозы соответствуют примерно 21- и 42-кратной ДСД бензоатов (500 и 1000 мг/кг бензоата натрия эквивалентны 424 и 847 мг/кг бензойной кислоты) и 75- и 150-кратной ДСД тартразина. При пересчете по площади поверхности тела (коэффициент для крысы 6,2 [18]) эквивалентные дозы для человека составляют около 81 и 161 мг/кг для бензоата натрия и 121 и 242 мг/кг для тартразина. Таким образом, режим введения многократно превышает реальное алиментарное поступление и предназначен для выявления структурных эффектов добавок, а не для моделирования пищевой нагрузки человека.

По окончании введения животным групп К+Д, Б500+Д, Б1000+Д, Т750+Д и Т1500+Д под эфирным масочным наркозом наносили сквозной дырчатый дефект диаметром 2,2 мм в проксимальном отделе диафиза обеих большеберцовых костей с помощью твердосплавного бора и эндодонтического мотора X-Smart (Dentsply Maillefer, Швейцария). Толщина кости в этой области (не менее 3,5 мм) позволяла создать сквозное отверстие без нарушения ее целостности и осевой нагрузки на конечность. Учитывая возможное влияние диэтилового эфира на центральную нервную систему, эфирный наркоз применяли как кратковременный управляемый вид анестезии; он выполнялся одинаково во всех группах с дефектом, включая группу К+Д, которая служила контролем в отношении операции и анестезии, а первое исследование мозжечка проводили не ранее чем через 3 суток после вмешательства. Животных (по 7 на срок) выводили из эксперимента декапитацией после ингаляции летальной дозы диэтилового эфира на 3, 10, 15, 24 и 45-е сутки после операции, что соответствует фазам воспаления, дифференцировки клеток, минерализации, ремоделирования и исхода репаративного остеогенеза; животных групп без дефекта выводили в те же сроки после окончания введения. Состояние костного регенерата в настоящей работе не анализируется: кристаллическую структуру биоминерала регенерата исследовали методом рентгеноструктурного анализа по ранее описанной методике [19]; результаты будут представлены в отдельной публикации.

После декапитации вскрывали черепную коробку, извлекали головной мозг и отделяли мозжечок по ножкам. Мозжечок фиксировали 24 ч в 10%-ном нейтральном забуференном формалине, промывали в проточной воде, обезвоживали в изопропиловом спирте возрастающей концентрации на гистопроцессоре MTP (SLEE Medical, Германия), заливали в парафиновую среду Histomix и на ротационном микротоме изготавливали серийные срезы толщиной 5–6 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином и толуидиновым синим по Нисслю. Микрофотографии получали цифровой фотокамерой Olympus SP-500UZ (Olympus, Япония).

Морфометрию выполняли с помощью микроскопа Nikon Eclipse Ni, камеры Nikon DS-Fi3 и программы NIS-Elements BR 4.60.00 (Nikon, Япония) после калибровки по объект-микрометру по ранее описанной методике [20]. Ширину слоев коры и численную плотность нейронов определяли в 10 полях зрения на животное (кора - объектив ×20, площадь поля 0,085 мм²; зубчатое ядро - объектив ×10, площадь поля 0,340 мм²), площадь тел нейронов и их ядер - по 25 профилям каждого типа клеток на животное при объективе ×100, обводя в ручном режиме плазмолемму и кариолемму; измеряли только профили с различимым ядрышком. Для каждого животного рассчитывали среднее значение показателя, которое служило единицей статистического анализа. Морфометрическую оценку выполняли без кодирования препаратов (без ослепления); для уменьшения субъективности применяли единые критерии отбора полей зрения и клеточных профилей и одинаковые настройки калибровки для всех групп. Определяли 16 показателей: ширину молекулярного и зернистого слоев; численную плотность (клеток/мм²) нейронов молекулярного слоя, клеток-зерен и клеток Пуркинье; площадь профильного поля нейронов молекулярного слоя, клеток-зерен и клеток Пуркинье, площадь ядер клеток Пуркинье и их ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО); в зубчатом ядре - численную плотность и площадь крупных и мелких нейронов, площадь ядер и ЯЦО крупных нейронов. ЯЦО рассчитывали для каждого животного по формуле ЯЦО = Sя / (Sкл − Sя), где Sя - средняя площадь ядра, Sкл - средняя площадь профиля тела нейрона, включающая ядро.

Данные представлены в виде M±m, где M - среднее, m - стандартная ошибка среднего (n = 7 на срок). Нормальность распределения проверяли критерием Шапиро - Уилка, равенство дисперсий - F-критерием Фишера; при нормальном распределении и равенстве дисперсий применяли t-критерий Стьюдента, в остальных случаях U-критерий Манна - Уитни; в тексте приводятся точные значения p. Каждую сочетанную группу сравнивали с контролем и с группой К+Д соответствующего срока (по 80 сравнений: 16 показателей × 5 сроков), а также с группой, получавшей ту же добавку без нанесения дефекта. Для контроля ошибки I рода в пределах каждого семейства из 80 сравнений применяли процедуру Бенджамини - Хохберга (доля ложных открытий ≤ 0,05) [21] и более строгую процедуру Холма [22]. Совместное действие факторов оценивали двухфакторным дисперсионным анализом по схеме «доза добавки (0 / первая / вторая) × дефект (нет / есть)» отдельно для каждого вещества, показателя и срока (42 животных в каждом анализе); рассчитывали F-критерий, p и силу влияния η² = SSфактора / SSобщ × 100%. Расчеты выполняли в среде Python 3.11 (SciPy 1.17).

Результаты исследования и их обсуждение

Изолированное нанесение дефекта (группа К+Д) сопровождалось статистически значимыми отличиями от контроля в 6 из 80 сравнений (табл. 1–3). На 3-и и 10-е сутки численная плотность нейронов молекулярного слоя была меньше контрольной на 22,7% (p = 0,011) и 20,0% (p = 0,012), клеток-зерен - на 11,3% (p = 0,040) и 11,0% (p = 0,047). Площадь мелких нейронов зубчатого ядра на 10-е и 15-е сутки превышала контроль на 24,7% (p = 0,018) и 24,4% (p < 0,001); последнее отличие сохраняло значимость и после поправки Холма. Плотность клеток Пуркинье была ниже контроля на 6,3–9,9%, а площадь их перикарионов и ядер, как и площадь ядер крупных нейронов зубчатого ядра, превышала контроль (до 9,0%, 13,6% и 15,4% соответственно), однако эти различия статистически не значимы (p ≥ 0,11). Качественно в ранние сроки в молекулярном слое выявлялись обратимые изменения нейронов по типу острого набухания и гипохроматоза, а среди клеток Пуркинье - гиперхромные клетки (рис. 1). К 24–45-м суткам показатели группы К+Д от контрольных не отличались. Таким образом, при изолированной костной травме на 3–10-е сутки снижается численная плотность нейронов молекулярного и зернистого слоев, а к 10–15-м суткам увеличивается площадь мелких нейронов зубчатого ядра; увеличение размеров клеток Пуркинье и крупных нейронов носит характер тенденции.

Изолированная травма сказывалась и на органометрических показателях головного мозга: его длина в группе К+Д была меньше контрольной на 3, 10 и 45-е сутки (на 2,9–4,6%), ширина - на 10-е и 45-е сутки (на 4,3% и 2,5%), а масса на 45-е сутки составила 2,51±0,05 г против 2,62±0,01 г в контроле (p < 0,05). Следовательно, костная травма оказывает на головной мозг собственное, хотя и умеренное, влияние, которое необходимо учитывать при оценке сочетанных воздействий.

Таблица 1

Число статистически значимых отличий морфометрических показателей мозжечка от контроля и от группы К+Д на разных сроках после нанесения дефекта (из 16 показателей на срок, 80 сравнений на группу)

Примечание: БХ - поправка Бенджамини - Хохберга, Холм - поправка Холма (в пределах 80 сравнений группы). Составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Рис. 1. Кора мозжечка крыс на 3-и сутки наблюдения: А, В - группа К; Б, Г - группа К+Д. А, Б - извилина коры (объектив ×10); В, Г - граница молекулярного и зернистого слоев (объектив ×40). 1 - молекулярный слой; 2 - клетки Пуркинье; 3 - зернистый слой.

Окраска гематоксилином и эозином.

Примечание: составлено авторами по результатам данного исследования

После предшествующего введения бензоата натрия изменения были минимальными: в группе Б500+Д отличий от контроля не выявлено, в группе Б1000+Д зарегистрировано одно - уменьшение численной плотности нейронов молекулярного слоя на 3-и сутки на 15,7% (p = 0,026), не сохранившее значимость после поправки на множественность сравнений. Площадь ядер клеток Пуркинье в группе Б1000+Д была меньше контроля на 4,5–11,4%, площадь ядер крупных нейронов зубчатого ядра - на 0,6–7,8% (p ≥ 0,14). Реактивного увеличения размеров нейронов, характерного для группы К+Д, не отмечалось, поэтому от группы изолированного дефекта группы Б500+Д и Б1000+Д отличались в 7 и 9 сравнениях - прежде всего меньшей площадью мелких нейронов зубчатого ядра на 10–15-е сутки (p = 0,0001–0,0008) и площадью ядер клеток Пуркинье (p = 0,007–0,018).

Предшествующее введение тартразина вызывало наиболее выраженные изменения, затрагивавшие прежде всего ядерный аппарат нейронов (табл. 2, 3; рис. 2). В группе Т750+Д площадь ядер клеток Пуркинье была уменьшена на 3–24-е сутки на 31,4–20,7% (p = 0,0001–0,019), их ЯЦО - на 3-и и 15-е сутки на 31,2% (p = 0,010) и 26,0% (p = 0,016), площадь ядер крупных нейронов зубчатого ядра - на 3-и и 10-е сутки на 22,3% (p = 0,018) и 23,3% (p = 0,004). В группе Т1500+Д площадь ядер клеток Пуркинье была уменьшена на 3–24-е сутки на 38,5–27,1% (p от < 0,0001 до 0,002), их ЯЦО - на 34,8–26,4% (p = 0,004–0,050), площадь перикарионов - на 3–15-е сутки на 16,3–12,6% (p = 0,002–0,028), площадь ядер крупных нейронов зубчатого ядра - на 3–24-е сутки на 33,3–16,8% (p = 0,0007–0,046). Кроме того, в этой группе на 3-и сутки была снижена численная плотность клеток-зерен (на 14,5%, p = 0,012), а на 3-и и 10-е сутки - нейронов молекулярного слоя (на 20,0%, p = 0,007, и на 16,4%, p = 0,003). После поправки Бенджамини - Хохберга в группе Т1500+Д значимыми остались 9 из 18 отличий (площадь ядер клеток Пуркинье на 3–24-е сутки, площадь их перикарионов и ЯЦО на 3-и сутки, площадь ядер крупных нейронов зубчатого ядра на 3–10-е сутки, плотность нейронов молекулярного слоя на 10-е сутки), после поправки Холма - 3 (площадь ядер клеток Пуркинье на 3–15-е сутки); в группе Т750+Д обеими процедурами подтверждено уменьшение площади ядер клеток Пуркинье на 3-и сутки. Плотность клеток Пуркинье в группах тартразина была меньше контроля на 5,2–12,3% без статистической значимости (p ≥ 0,16). От группы К+Д группы Т750+Д и Т1500+Д отличались в 17 и 27 сравнениях из 80.

Таблица 2

Морфометрические показатели коры мозжечка крыс после нанесения дефекта большеберцовой кости (M±m, n = 7)

Примечание: * - статистически значимое отличие от группы К (p < 0,05); # - от группы К+Д (p < 0,05). ЯЦО = Sя / (Sкл − Sя). Составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Во всех сочетанных группах изменения были максимальными на 3-и сутки и затем уменьшались: число статистически значимых отличий от контроля на 3, 10, 15, 24 и 45-е сутки составило 3, 2, 2, 1 и 0 в группе Т750+Д и 6, 5, 4, 3 и 0 в группе Т1500+Д (табл. 1, рис. 2). На 45-е сутки ни в одной группе отличий от контроля не выявлено, хотя площадь ядер клеток Пуркинье в группе Т1500+Д оставалась меньше контрольной на 11,3% (p = 0,145).

Рис. 2. Площадь ядер клеток Пуркинье в группах с нанесением дефекта большеберцовой кости, % отклонения от контроля соответствующего срока (0 - уровень контроля).

Над столбцами указаны значения отклонения; * - статистически значимое отличие от контроля (p < 0,05).

Примечание: составлено авторами по результатам данного исследования

Отделы зубчатого ядра реагировали на сочетанное воздействие неодинаково (табл. 3).

Качественно на 3-и сутки в группе Т750+Д в ганглионарном слое коры выявлялись сморщенные клетки Пуркинье с гомогенной гиперхромной цитоплазмой и нечетким ядром и единичные клетки-тени. В зубчатом ядре в группе К крупные нейроны располагались равномерно и имели четко контурированные ядро и ядрышко; в группе Б1000+Д наряду с такими нейронами встречались единичные сморщенные гиперхромные клетки, а в группе Т750+Д - многочисленные сморщенные гиперхромные нейроны веретеновидной формы, окруженные зоной перицеллюлярного отека (рис. 3). После введения тартразина изменения затрагивали прежде всего магноцеллюлярный отдел: на 3-и сутки площадь ядер крупных нейронов в группах Т750+Д и Т1500+Д была меньше контрольной на 22,3% и 33,3% соответственно (p = 0,018 и p = 0,0007), тогда как снижение численной плотности мелких нейронов в этих группах (на 13,9% и 17,4%) статистической значимости не достигало (p ≥ 0,32). После введения бензоата натрия площадь ядер крупных нейронов от контроля значимо не отличалась, а плотность мелких нейронов в группе Б1000+Д была ниже контрольной на 5,1–9,3% на протяжении всего наблюдения (p ≥ 0,47). При изолированном дефекте увеличивалась площадь мелких нейронов (на 24,7% и 24,4% на 10-е и 15-е сутки), а площадь ядер крупных нейронов имела тенденцию к увеличению (на 15,4% на 15-е сутки, p = 0,11). Различия в поведении отделов носят характер тенденции и могут отражать неодинаковую чувствительность нейронов магно- и парвоцеллюлярного отделов к двум добавкам, что требует проверки другими методами.

Рис. 3. Мозжечок крыс на 3-и сутки наблюдения: А - кора, группа Т750+Д (объектив ×40); Б - зубчатое ядро (обведено пунктиром), группа К (объектив ×10); В - зубчатое ядро, группа Б1000+Д (объектив ×40); Г - зубчатое ядро, группа Т750+Д (объектив ×40). 1 - сморщенные гиперхромные нейроны с гомогенной цитоплазмой и нечетким ядром; 2 - клетка-тень; 3 - нейрон с сохранными ядром и ядрышком; 4 - перицеллюлярный отек.

Окраска гематоксилином и эозином.

Примечание: составлено авторами по результатам данного исследования

Таблица 3

Морфометрические показатели нейронов зубчатого ядра мозжечка крыс после нанесения дефекта большеберцовой кости (M±m, n = 7)

Примечание: * - статистически значимое отличие от группы К (p < 0,05); # - от группы К+Д (p < 0,05). ЯЦО = Sя / (Sкл − Sя). Составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

При одинаковой кратности референтной ДСД (100- и 200-кратной) группы тартразина отличались от групп бензоата натрия в 10 (Т750+Д и Б500+Д) и 14 (Т1500+Д и Б1000+Д) сравнениях из 80 - преимущественно по площади ядер и ЯЦО клеток Пуркинье и площади ядер крупных нейронов зубчатого ядра, тогда как между дозами одного вещества различий не выявлено. Сочетанные группы не отличались от групп, получавших те же добавки без нанесения дефекта, ни в одной из четырех пар (0 из 80 сравнений в каждой).

Результаты двухфакторного дисперсионного анализа для основных показателей приведены в таблице 4 (полностью - в дополнительных материалах). Для тартразина статистически значимое влияние фактора «доза» выявлено в 34 из 80 анализов; наибольшая сила влияния отмечена для площади ядер клеток Пуркинье (η² = 62,9–79,4% на 3–24-е сутки, p < 0,001) и площади ядер крупных нейронов зубчатого ядра (η² = 35,7–65,5%, p < 0,001). Для бензоата натрия влияние дозы было значимо в 10 анализах, и его сила не превышала 34,9% (площадь ядер клеток Пуркинье на 10-е сутки). Фактор «дефект» был значим в 5 (бензоат натрия) и 3 (тартразин) анализах, наиболее выраженно - для площади мелких нейронов зубчатого ядра на 10–15-е сутки (η² = 12,2–18,0%). Статистически значимое взаимодействие факторов «доза × дефект» выявлено лишь в 4 (бензоат натрия) и 6 (тартразин) анализах из 80 - для плотности нейронов молекулярного и зернистого слоев и ширины зернистого слоя на 3–10-е сутки и площади мелких нейронов зубчатого ядра на 10–15-е сутки (η² = 8,6–24,4%). Таким образом, статистически значимое взаимодействие факторов в большинстве анализов не выявлено; поскольку при α = 0,05 около 4 из 80 анализов могут оказаться значимыми случайно, единичные эффекты взаимодействия следует рассматривать как предварительные.

Таблица 4

Результаты двухфакторного дисперсионного анализа «доза добавки × дефект» для основных показателей мозжечка (F; p; η², %)

Примечание: число степеней свободы - 2 и 36 для фактора «доза» и взаимодействия, 1 и 36 для фактора «дефект»; ЗЯ - зубчатое ядро. Составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Полученные данные позволяют разграничить вклад двух факторов. Изменения при изолированном дефекте затрагивают прежде всего плотность нейронов молекулярного и зернистого слоев, модулирующих активность клеток Пуркинье, а увеличение размеров нейронов нарастает к 15-м суткам и исчезает к 24–45-м суткам. Такая динамика совпадает с периодом нарушения опороспособности конечности и перестройки локомоторного стереотипа. Мозжечок обеспечивает адаптацию локомоции на основе ошибок сенсорного прогноза [23], а освоение нового двигательного навыка, в отличие от простой двигательной нагрузки, вызывает у взрослых крыс синаптогенез и гипертрофию астроцитов в коре мозжечка [24; 25]. Кроме того, ноцицептивная импульсация модулирует активность клеток Пуркинье через бергмановскую глию [26]. Поэтому увеличение размеров нейронов при изолированном дефекте авторы рассматривают как возможное проявление функциональной нагрузки, а не токсического повреждения.

В сочетанных группах, особенно после введения тартразина, такой реакции не наблюдалось, а площадь ядер и ЯЦО нейронов уменьшались. Уменьшение размеров ядра может отражать снижение функциональной, в том числе синтетической, активности нейронов, однако морфометрические данные не позволяют оценить ее непосредственно: для такого заключения необходимы гистохимические, иммуногистохимические или ультраструктурные исследования. Выявленные изменения согласуются с данными о роли оксидативного стресса, воспаления и апоптоза в нейротоксичности обеих добавок [4; 5; 8] и о более выраженном повреждении коры мозжечка при действии тартразина [6; 7]. Можно предположить, что системная воспалительная реакция при переломе, сопровождающаяся активацией глии в головном мозге [10; 11], усиливает повреждение нейронов, антиоксидантный резерв которых снижен предшествующей интоксикацией. Однако единичные эффекты взаимодействия факторов и отсутствие различий между сочетанными группами и группами без дефекта указывают, что в условиях эксперимента вклад такого механизма, если он существует, невелик. Результаты следует интерпретировать с учетом высоких доз добавок, небольшой численности подгрупп и числа проведенных сравнений, поэтому основное внимание уделено отличиям, сохранившим значимость после поправки на множественность сравнений.

Полученные данные имеют прежде всего фундаментальное значение, раскрывая механизмы нейротоксичности пищевых добавок в эксперименте: они показывают, что предшествующее длительное введение высоких доз тартразина и в меньшей степени бензоата натрия изменяет морфометрический ответ мозжечка на травму опорно-двигательного аппарата. У животных, не получавших добавок, ответ на костный дефект проявлялся значимым увеличением площади мелких нейронов зубчатого ядра и тенденцией к увеличению размеров клеток Пуркинье и крупных нейронов и их ядер; после предшествующего введения тартразина такого ответа не наблюдалось, а площадь ядер нейронов уменьшалась. Дальнейшее изучение целесообразно направить на оценку эффектов добавок в дозах, близких к действующим ДСД, на обратимость изменений в более отдаленные сроки и на функциональную характеристику нейронов.

Заключение

Изолированное нанесение дефекта большеберцовой кости сопровождается умеренными и обратимыми изменениями коры и зубчатого ядра мозжечка крыс: снижением численной плотности нейронов молекулярного и зернистого слоев на 3–10-е сутки и увеличением площади мелких нейронов зубчатого ядра на 10–15-е сутки. На фоне предшествующего 60-суточного введения пищевых добавок в высоких дозах морфометрическая картина мозжечка определяется преимущественно видом и дозой добавки: после введения бензоата натрия отличия от контроля единичны, после введения тартразина уменьшаются площадь ядер и ЯЦО клеток Пуркинье и площадь ядер крупных нейронов зубчатого ядра (уменьшение площади ядер клеток Пуркинье сохраняет значимость после поправки на множественность сравнений), а увеличения размеров нейронов, характерного для изолированной травмы, не наблюдается. Изменения максимальны на 3-и сутки, к 45-м суткам статистически значимые отличия от контроля не выявляются. Статистически значимое взаимодействие факторов «доза × дефект» выявлено лишь в единичных анализах в ранние сроки.