Оксид азота NO рассматривается как устойчивый свободный радикал. NO - эндотермическое соединение со стандартной теплотой образования ∆Н˚₂₉₈ = 90,4 кДж/моль. Стандартный изобарный потенциал образования ∆G˚₂₉₈ также имеет положительное значение (90 кДж/моль). Молекула NO парамагнитна. Согласно методу молекулярных орбиталей, в NO один из электронов находится на π_р ^разр - орбитали: (σ_s^cв)² (σ_s^разр)² (π_р^cв)⁴ (σ_х^cв)² (π_р^разр)¹, т.е. порядок связи в NO составляет 2,5 [1]. Будучи липофильным соединением не имеющим заряда, NO легко диффундирует в биологических средах и является достаточно долгоживущим: среднее время жизни в биологических тканях 5,6 с [3]. NO имеет огромное физиологическое значение, однако его молекула может реагировать с другими свободными радикалами. Энергия ионизации NO составляет 9,3 эв, следовательно молекула NO может терять непарный электрон с π_р^разр - ­­­­­­­­­­орбитали, образуя нитрозил (нитрозоний) - ион NO⁺. Также NO может выступать как окислитель и присоединять электрон с образованием неустойчивого аниона NO^-. Учитывая возможность окислительно-восстановительных реакций с участием молекулы NO и ее производных, при неблагоприятных условиях метаболизма может возникнуть нитрозилирующий стресс. Поэтому контроль за уровнем NO-метаболитов является актуальной задачей биохимии. Ранее В. А. Метельской, Н.Г. Гумановой (2005) [4] была описана методика определения уровня NO-метаболитов в сыворотке крови с применением прибора «Labsystems Vultiskan MCC/340» по принципу вертикального фотометрирования. Определенно, наличие такого оборудования облегчает и ускоряет проведение анализа, однако очень часто лаборатории оснащены другими, менее современными приборами, что диктует поиск модифицированных методик определения NO-метаболитов в разных тканях.

Вышесказанное определило цель нашей работы - исследовать возможность спектрофотометрического определения уровня NO-метаболитов в плазме крови и ткани мозга белых крыс разного пола и возраста с применением спектрофотометра марки ПЭ 5400В или его аналогов.

Материалы и методы. Для достижения поставленных целей нами был использован спектрофотометрический метод определения нитрит-иона [4], основанный на реакции нитритов с реактивов Грисса, который представляет собой смесь равных объёмов водного раствора 0,05 % N-нафтилэтилендиамина и 1 ­% раствора сульфаниламида в уксусной кислоте. Данный метод количественного определения нитрит-ионов основан на способности первичных ароматических аминов в присутствии азотистой кислоты образовывать интенсивно окрашенные диазосоединения.

Максимум полосы поглощения образующегося соединения лежит при λ 540 нм. Поскольку реактив Грисса, с помощью которого проводятся определения, позволяет детектировать только нитрит-ион, необходимым условием анализа является перевод нитрата в нитриты, что достигается взаимодействием нитрат-ионов с хлоридом ванадия (III). Одновременно в реакционной среде протекает реакция диазотирования сульфаниламида образовавшимся нитритом с последующим развитием розовой окраски, интенсивность которой определяется спектрофотометрически. Учитывая, что хлорид ванадия (III) - лёгкий, летучий порошок, моментально окисляющийся в кислороде воздуха, склянку с ним хранили в эксикаторе в атмосфере азота. Все операции при приготовлении раствора хлорида ванадия (III) проводили за максимально короткое время в вытяжном шкафу. Для предотвращения гидролиза раствор хлорида ванадия (III) готовили на 1н соляной кислоте. В кислой среде в присутствии избытка хлоридных ионов образуются комплексы [VCℓ₄ (Н₂О)₂]ˉ и их производные [1].

Для построения калибровочной кривой использовали 1М водный раствор NaNO₂. Перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения градуировочного графика. Так как по предварительно полученным данным линейность кривой сохраняется в диапазоне концентрации нитрит-иона от 5 до 100 мкМ, из 10^{-3 М раствора} NaNO₂ получали растворы с концентрациями 5; 10; 20; 30; 50; 60; 70; 80; 90; 100 мкМ. Готовили серию из 10 пробирок, содержащих по 0,7 мл растворов NaNO₂ с соответствующими концентрациями. Далее добавляли по 0,7 мл свежее приготовленного раствора хлорида ванадия и по 0,7 мл реактива Грисса. Соблюдая указанные условия в методике, пробирки помещали на 30 минут в водяную баню при температуре 37˚С. Каждый раствор серии готовили в 5 повторах. Измеряли оптическую плотность на спектрофотометре марки ПЭ 4000В в кюветах с расстоянием между светопропускающими гранями 0,5 см при длине волны 540 нм. По полученным оптическим плотностям и известным концентрациям строили калибровочный график.

По методу наименьших квадратов было рассчитано уравнение калибровочного графика [2].

Оно имеет вид: y_i = 0,021 + 0,00228х

Для решения вопроса о возможности применения методики спектрофотометрического определения уровня NO-метаболитов в разных биологических объектах использовали плазму крови и ткань головного и спинного мозга самцов белых крыс. Беспородные белые лабораторные крысы-самцы (40 животных) содержались в стандартных условиях вивария. Содержание крыс в виварии и проведение экспериментов соответствовали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», разработанным и утвержденным МЗ СССР (1977 г.), а также принципам Хельсинкской декларации (2000 г.). Декапитацию животных производили после наркотизации этаминалом натрия (внутрибрюшинно в дозе 5 мг на 100 г массы тела). После декапитации собирали кровь в пробирки, обработанные гепарином, центрифугировали и отбирали плазму для анализов. Весь биологический материал (головной и спинной мозг) подвергали быстрой заморозке при -20 С° в морозильной камере промышленного образца. Гомогенаты мозга готовили на фосфатном буферном растворе (рН 7,45) на холоде в кратчайшие сроки непосредственно перед исследованиями.

Определение нитрит ионов проводили после депротеинизации: к 1 мл плазмы крови добавляли двукратный избыток 96˚ этилового спирта, образовавшийся осадок денатурата отделяли центрифугированием при 3000 оборотов в минуту в течение 20 минут. Все последующие операции проводили аналогично, как и при получении растворов для градуировочного графика, соблюдая те же объемы реагентов, последовательность операций, временной и температурный режимы. Оптическую плотность раствора определяли при 540 нм. Количество нитрит-иона рассчитывали в мкмолях по калибровочной кривой. Таким способом определяли содержание суммарных метаболитов NO. Для измерения концентрации нитрита депротеинизированную плазму крови инкубировали с реактивом Грисса без добавления VCℓ₃, а концентрацию нитратов рассчитывали, вычитая из уровня суммарных метаболитов концентрацию нитритов.

Приведенная методика была откорректирована для проведения анализа ткани мозга на содержание метаболитов монооксида азота. Гомогенаты центрифугировали с целью отделения твердых включений, затем проводили депротеинизацию добавлением двукратного избытка по объему 96˚ этанола. Образовавшийся осадок денатурата отделяли центрифугированием при 3000 оборотов в минуту, однако в отличие от плазмы крови эту операцию проводили не менее 45 минут. В некоторых случаях требовалось повторное центрифугирование, т. к. осадок при депротеинизации ткани мозга получался менее плотный и менее тяжелый, чем при анализе плазмы крови. Все остальные операции аналогичны описанным выше.

Результаты.

По указанной выше методике определяли содержание суммарных метаболитов NO в плазме крови и разных отделах ЦНС: большие полушария, промежуточный, средний мозг, мозжечок, продолговатый и спинной мозг. Эксперименты проводили на самцах и самках двух возрастных групп (6 и 24 месяца). Полученные результаты представлены в табл. и свидетельствуют о более высоком уровне NO-метаболитов в исследованных объектах самок, по сравнению с самцами одной возрастной группы.

Таблица. Уровень метаболитов монооксида азота в плазме крови и ткани мозга

	Концентрация суммарных метаболитов NO, мкМ, (М±m)
	Молодые (6 месяцев)		Старые (24 месяца)
	самцы	самки		самцы	самки
Плазма крови	30,28±1,83	78,35±5,103#		67,24±3,362∆	54,14±1,998#∆
Большие полушария	19,1±0,573	38,4±1,536 #		20,51±1,026	40,15±1,606#
Промежуточный мозг	15,7±0,65	33,10±1,19 #		28,14±1,182∆	27,73±0,971 ∆
Средний мозг	18,5±0,777	51,2±1,792 #		22,17±1,058∆	48,49±1,455#
Мозжечок	28,6±1,144	46,8±1,217 #		31,58±1,579	40,11±1,203#∆
Продолговатый мозг	27,11±1,084	62,38±2,807#		38,71±1,936∆	51,17±2,047#∆
Спинной мозг	28,4±1,42	29,5±1,003		30,58±1,233	32,79±1,180

# - достоверно по сравнению с самцами того же возраста; ∆ - достоверно по сравнению с группой молодых животных.

Наиболее ярко половые различия выражены у молодых животных. С возрастом в результате разнонаправленного изменения уровня NO-метаболитов у крыс разного пола различия между самцами и самками уменьшаются. В спинном мозге у животных всех групп уровень монооксида азота примерно одинаков. Вероятно, это связано с тем, что спинной мозг является наиболее филогенетически древним отделом ЦНС.

Полученные результаты лежат в биологически допустимом диапазоне и согласуются с данными других авторов [4, 5], что позволяет применять описанную методику для определения уровня NO в различных биологических объектах.

Выводы. На основании полученных результатов показано, что модифицированная методика спектрофотометрического определения уровня NO-метаболитов позволяет получить воспроизводимые результаты не только в сыворотке [4], но и в плазме крови, а также в гомогенатах из ткани мозга. При условии достаточного количества биологического материала измерение оптической плотности полученных растворов возможно на спектрофотометрах марки ПЭ 4000В или его аналогов. Полученные результаты свидетельствуют о половых и возрастных особенностях уровня NO-метаболитов в плазме крови и ткани мозга.

Рецензенты:

• Тризно Н.Н., д.м.н., профессор, зав. кафедрой патологической физиологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Астрахань.
• Фельдман Б.В., д.б.н., зав. кафедрой биологии с курсом ботаники Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Астрахань.

Работа получена 27.07.2011.