Введение

Поиск новых эффективных гепатопротекторов для лечения и профилактики заболеваний печени является актуальным направлением современной медицины. Существуют исследования, показывающие возможность цитопротекторного действия тималина и стволовых клеток [2, 6].

Интегрирующим критерием наличия гепатопротекторного действия вещества или препарата является процент выживаемости животных после отравления высокими дозами тетрахлорметана.

Важным и доступным методом оценки тяжести гепатита является исследование содержания общей воды в печени. Оценка этого критерия не исключает выявление действия исследуемых веществ на процессы воспаления через нейрогуморальную регуляцию [3, 5].

Гистологическое изучение образцов органов и тканей позволяет оценить произошедшие под влиянием токсического агента морфологические изменения, определить их характер, локализацию и степень повреждения органа, предположить и выявить механизм гепатотропного эффекта [1].

Рабочей гипотезой исследования является предположение о наличии у комплекса тималин + суспензия красного костного мозга (ККМ) гепатопротекторного действия.

Целью исследования было изучение гепатотропного действия тималина и его комбинации с ККМ при тетрахлорметановом поражении печени мышей. Этот эффект должен был быть выявлен по трем критериям: проценту выживаемости мышей, содержанию общей воды в печени мышей и количеству сохраненных ядер гепатоцитов на гистологическом срезе печени мышей.

Материалы и методы исследования

Опыты проводили на белых мышах массой 25-30 г., содержавшихся в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде.

В первой серии опытов при изучении выживаемости животных их разделили на 2 группы:

1 - контрольная группа - отравленные тетрахлорметаном мыши;

2 - опытная группа - отравленные тетрахлорметаном мыши и получавшие комплекс «тималин + суспензия ККМ».

Количество животных в каждой группе - 10.

Суспензию ККМ получали от мышей-доноров путем промывания полостей двух большеберцовых и двух бедренных костей одним 1 мл 5 % раствора натрия цитрата. Приготовленную суспензию ККМ вводили внутрибрюшинно в дозе - 0,5 мл на одно животное-реципиент.

Тетрахлорметан 50 % масляный раствор вводили в желудок через зонд в количестве 3,2 мл/кг.

Физиологический раствор вводили в количестве 0,05 мл на мышь внутримышечно.

Тималин вводили в дозе 0,05 мг на мышь внутримышечно.

Наблюдения за выживаемостью продолжали в течение двух недель от начала эксперимента.

План эксперимента представлен в таблице 1.

Таблица 1. План введения ТХМ и препаратов в первой серии опытов

* план не выполнен - все животные контрольной группы на 4 день погибли.

Во второй отдельной серии экспериментов изучали уменьшение процента содержания воды (воспалительного экссудата) [3, 5] и гистологические изменения в печени животных.

В этой серии животных - разделили на 5 групп:

1 - интактная группа;

2 - контрольная группа - тетрахлорметановый гепатит;

3 - опытная группа «A» - тималин;

4 - опытная группа «Б» суспензия ККМ;

5 - опытная группа «В» тималин + суспензия ККМ.

Количество животных в каждой группе - 10.

В этой серии опытов 50 % масляный раствор тетрахлорметана вводили в желудок через зонд в количестве 2,7 мл/кг (меньше чем в опытах на выживаемость).

Тималин вводили в дозе 0,05 мг на мышь внутримышечно, как и в первой серии опытов.

Суспензию ККМ как и в первой серии опытов на выживаемость, но приготовленную суспензию ККМ вводили внутрибрюшинно в дозе - 0,1 мл на одно животное-реципиент.

Для определения общей воды как критерия интенсивности воспаления брали нативные образцы печени у животных, забитых на пятый день опыта. На аналитических весах взвешивали печень мышей до и после высушивания, которое проводили в течение пяти суток при температуре 60 ^oC.

Гистологическим критерием оценки качества пораженной печени служило число сохранившихся ядер гепатоцитов. Для их подсчета использовали цифровой снимок среза печени при увеличении в 800 раз. Число ядер подсчитывали на 10 снимках с экрана монитора с помощью сетки для изображения в приложениях программы Office 2007.

Для определения гистологических изменений образцы печени фиксировали в формалине, а затем готовили срезы и окрашивали раствором Гимза.

После стандартной статистической обработки (среднее арифметическое, ошибка репрезентативности) определяли достоверность различий между контрольными и опытными группами по критерию Стьюдента [4].

План эксперимента представлен в таблице 2.

Таблица 2. План введения препаратов во второй серии опытов

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты исследования выживаемости мышей представлены в таблице 3.

Таблица 3. Выживаемость животных в 1-й серии опытов

Из таблицы 3 видно, что двукратное введение ТХМ в дозе 3,2 мл/кг 50 % масляного раствора приводило к 100 % гибели животных контрольной группы на четвертый день эксперимента.

Выживаемость животных опытной группы на этот день составляла 100 %. После третьего введения тетрахлорметана выживаемость в опытной группе снизилась до 80 %.

Результаты исследования содержания общей воды в печени мышей представлены в таблице 4.

Таблица 4. Процент уменьшения содержания воды в печени мышей во 2-й серии опытов

М - среднее арифметическое, m - ошибка среднеквадратичного отклонения, t - критическое значение коэффициента Стьюдента (при n=10 составляет 2,2).

Из таблицы 4 видно, что введение ТХМ приводило к достоверному увеличению процента содержания воды (воспалительного экссудата) в печени в сравнении с интактной группой мышей.

Во всех трёх опытных группах наблюдали уменьшение процента содержания воды (воспалительного экссудата) в печени в сравнении с контрольной группой животных, получавших только тетрахлорметан.

Результаты исследования гистологических изменений в печени мышей представлены в таблице 5 и на рисунках 1-2.

Таблица 5.  Количество ядер гепатоцитов на микропрепаратах (х800) печени мышей с экспериментальным поражением печени

М - среднее арифметическое, m - ошибка среднеквадратичного отклонения, t - критическое значение коэффициента Стьюдента (при n=10 составляет 2,2).

Из таблицы 5 видно, что введение ТХМ приводило к достоверному снижению количества ядер в контрольной группе по сравнению с интактной.

В опытной группе «В» - комплекс ККМ+тималин, наблюдалось достоверно большее число ядер по сравнению с группой контроля ТХМ. При этом гепатопротекторный эффект комплекса сопоставим с аналогичным эффектом опытных групп «А» - тималин и «Б» -суспензия ККМ.

                         х90                                                                   х800

Рисунок 1. Гистологические препараты печени мышей контрольной группы (ТХМ)

                         х90                                                               х800

Рисунок 2. Гистологические препараты печени мышей опытной группы «В» (ТХМ +ККМ + тималин)

Из рисунков 1 и 2 видно, что микроструктура печени мышей контрольной группы отравленных ТХМ хуже, чем у мышей опытной группы, получавших при отравлении комплекс «ККМ+тималин». Большее количество ядер гепатоцитов в опытной группе.

Выводы

1. Комбинация ККМ + тималин повышает выживаемость мышей на 80-100 % при остром токсическом поражении печени.
2. Суспензия ККМ мышей и комбинация ККМ + тималин достоверно снижают содержание воды в печени.
3. В опытных группах «А», «Б», «В» на гистологических срезах наблюдалось достоверное увеличение числа ядер по сравнению с контролем.

Заключение

Комплекс «тималин + суспензия ККМ» обладает гепатопротекторной активностью при токсическом поражении печени мышей тетрахлорметаном и является перспективным объектом дальнейшего фармакологического изучения.

Рецензенты:

• Ивашев Михаил Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой клинической фармакологии «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Пятигорск.
• Погорелый Василий Ефимович, доктор биологических наук, профессор кафедры фармакологии и патологии «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Пятигорск.