Введение. Благодаря хорошей приспособляемости к различным условиям внешней среды микроскопические грибы успешно выдерживают конкуренцию с другими микроорганизмами и часто вытесняют их с того или иного субстрата. На данный момент известно более 500 тысяч видов микроскопических грибов, большинство которых представлено сапрофитами. Около 50 видов являются патогенными. Патогенные грибы многочисленные, а вызываемые ими заболевания человека, животных и насекомых разнообразны. Патогенными для медоносной пчелы являются грибы родов Ascosphaera, Mucor, Rhisopus, Aspergillus.

Стрессовые факторы, физические, химические, биологические, экстремальные температуры и высокая влажность, загрязнение окружающей среды, отравление пестицидами, бесконтрольное применение антибиотиков, паразитарные инвазии - вызывают снижение резистентности организма насекомого к микозам, нарушая иммунную систему, защитные барьеры оболочек тела, пищеварительного тракта, трахей и способствуя развитию грибковой инфекции [1; 2].

Из микозов, патогенных для пчел, значительное распространение повсеместно получил известковый расплод - аскосфероз. В пятидесятых годах прошлого столетия аскосфероз был зарегистрирован в США и Канаде на пчелах - листорезах и одиночных пчелах Antrophora pacifica, а уже через десять лет имел широкое распространение на пасеках мира.

Заболевание чаще наблюдается в активный период жизнедеятельности пчелосемьи, при наличии расплода. Заражение пчел грибами начинается с прорастания спор. Инвазивная гифа проникает через кутикулу механически и энзиматически, попадает в гемоцель, где быстро развивается и прорастает. Иногда заражение может начинаться от заглоченных спор грибов, которые прорастают в кишечнике. Вначале поражаются трутневые личинки. Из спор прорастает мицелий, который постепенно поражает все органы и ткани насекомого, прорастает на поверхность, покрывая головной конец личинки войлочным налетом [2; 3; 5].

Цель исследований: выделить чистую культуру гриба Ascosphaera apis.

Для этого необходимо:

• изучить и дифференцировать с помощью электронной микроскопии два подвида этого гриба Ascosphaera apis var. apis, A. apis var. major, отличающихся размерами споровых цист и спор;
• дифференцировать полученную культуру гриба путем микроскопического и микологического исследований, имея в виду аспергиллез и возможность развития на перге гриба Battsia alvei (Ascosphaera).

Материалы и методы

При проведении исследований использовались методические указания по лабораторной диагностике аскосфероза пчел и выделению возбудителя из пыльцы (перги); утвержденные 9 апреля 1986 года [4].

В исследованиях использовали следующие материалы:

• образцы сотов (соты) размером 10×15 см с больными и погибшими личинками, куколками;
• предметное стекло, 50%-ный водный раствор глицерина для микроскопического исследования. Исследование проводили при малом увеличении микроскопа (7×10);
• питательная среда - агар Сабуро для получения чистой культуры гриба из патологического материала;
• микрофотосъемку гистологических препаратов проводили на микроскопе Axio Scope 40 (Carl Zeiss) и Axio Star (Carl Zeiss) с встроенным ТV-адаптером и цифровой видеокамерой Carl Zeiss Imager, A1, окуляр W-PI 10x/23, объективы: Achroplan 20х/0,45, 40x/0,60, 63x/0,80 и 100x/1,25 oil.

Микрофотосъемку гистологических препаратов проводила кандидат ветеринарных наук М.Н. Гонохова. ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина», Омск, Россия (644122, г. Омск, ул. Октябрьская, 92).

Результаты исследований и их обсуждение

Для получения чистой культуры гриба из патологического материала (1-2 трупов пораженных личинок и 10%-ной эмульсии пыльцы (перги) на стерильном физиологическом растворе) делали посев на питательную среду агар Сабуро.

Рис. 1. Посев на питательную среду агар Сабуро.

Перед посевом питательный агар расплавляли в водяной бане и после охлаждения до 45-50 °С добавляли в него антибиотики (пенициллин 50 ЕД и стрептомицин 100 ЕД на 1 мл среды) для подавления сопутствующей бактериальной микрофлоры.

Пораженные личинки извлекали из ячеек, помещали в стерильную чашку Петри, разламывали их с помощью препаровальной иглы. Затем частицы размером не более 1 мм и эмульсию пыльцы помещали при помощи бактериологической петли в чашки Петри с одной из питательных сред в 3-5 точек (по одной частице в каждую точку). Посевы выдерживали при 26-30 °С и наблюдали за ними в течение 10 сут., имея в виду, что в процессе развития гриба на поверхности среды на 3-5-е сут. появляются белые пушистые колонии, которые в дальнейшем могут приобретать вид зеленовато-серого, войлокообразного налета.

Рис. 2. культура гриба Ascosphaera apis.

Чистую культуру гриба Ascosphaera apis получили путем дополнительного пересева культуры с периферии колоний, характерных для данного гриба.

Рис. 3. Пересев культуры гриба Ascosphaera apis.

Мазки из культуры исследовали под микроскопом. При положительном результате обнаружили многоклеточный септированный мицелий с многоядерными клетками, ветвистые гифы, споровые шары, которые, в свою очередь, заключены в шаровидную цисту. Споры мелкие, эллиптические, гладкие.

Рис. 4. В поле зрения гифы, споровые цисты.

Встречаются два подвида этого гриба: Ascosphaera apis var. Apis и Ascosphaera apis var. major, отличающиеся размерами споровых цист и спор.

Ascosphaera apis var. apis имеет размеры спор 3-3,8 × 2,3 мкм и диаметр споровых цист 32-99 мкм (в среднем 65,8 мкм), а A. apis var. major имеют размеры спор 3,3-4,2 × 2,5 мкм и диаметр споровых цист 88.4-168 мкм (в среднем 128,4 мкм).

Рис. 5. В поле зрения немногочисленные споровые цисты Ascosphaera apis var. apis. Размер споровых цист 39,41 мкм.

Одновременно дифференцировали полученную культуру гриба (аспергиллез) и возможность развития на перге гриба Battsia alvei (Ascosphaera), отличающегося от возбудителя аскосфероза пчел тем, что он не поражает расплод пчелиных семей, а часто поражает ячейки с пыльцой (пергой) осенью и весной, так как лучше растет при температуре до 20 °С. Гриб Battsia alvei не образует внутри спороцисты споровых шаров, и аскоспоры лежат свободно в спороцисте.

Лабораторный диагноз на аскосфероз устанавливали на основании положительных результатов микроскопического и микологического исследований.

Срок лабораторного исследования до 10 дней. При выделении из пыльцы (перги) гриба Ascosphaera apis ее нельзя использовать в качестве белковой подкормки пчелиным семьям.

Выводы

Из микозов, патогенных для пчел и наносящих большой ущерб пчеловодству на пасеках Омской области, получил распространение известковый расплод - аскосфероз.

В ходе проведенных исследований:

1. выделена культура гриба Ascosphaera apis;
2. изучены и дифференцированы с помощью электронной микроскопии два подвида этого гриба Ascosphaera apis var. apis, Ascosphaera apis var. мajor;
3. дифференцирована полученная культура гриба путем микроскопического и микологического исследований (аспергиллез) и возможность развития на перге гриба Battsia alvei (Ascosphaera).

Рецензенты

• Рудаков Н.В., д.мед.н., профессор, директор Омского научно-исследовательского института природноочаговых инфекций, г. Омск.
• Бажин М.А., д.вет.н., профессор Всероссийского НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхозакадемии, г. Омск.