Введение  

Знания об ассоциации полиморфизма аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы с мукомольно-хлебопекарными и технологическими свойствами зерна имеют большую практическую значимость и, в совокупности с молекулярными методами геноидентификации, используются в маркер-вспомогательной селекции при создании сортов пшеницы с высокими качественными показателями зерна [1-5].

Известно, что нефункциональные нуль-аллели локусов Wx-A1, Wx-B1 и Wx-D1 Waxy-генов пшеницы имеют прямое влияние на образование крахмала амилопектинового типа, где наиболее существенное снижение содержания амилозы оказывает нулевой аллель Wx-B1-локуса – Wx-B1b, идентификация которого имеет диагностическую ценность [1-5].

Целью настоящей работы являлась апробация способов проведения ПЦР для идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы на образцах яровой пшеницы отечественной селекции.

Материалы и методы исследования

Апробация общеизвестного [4] и разработанного нами способов проведения ПЦР для идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы проведена на 70 образцах яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ.

Выделение геномной ДНК из зерновок растений яровой пшеницы молочно-восковой спелости урожая 2012 г. осуществлена коммерческим набором «ДНК-сорб С» («ЦНИИ эпидемиологии», Россия).

ПЦР-амплификация геномной ДНК выполнена на термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Россия) с использованием олигонуклеотидных праймеров, перечень которых представлен в табл. 1.

Таблица 1. Апробированные способы проведения ПЦР (№1-4) для идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы

Детекция результатов ПЦР-анализа проведена методом горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле в буфере ТBE (рН 8,0), содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов реакции в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ=310 нм).

Результаты исследования и их обсуждение

В процессе верификация способов проведения ПЦР для идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы было проведено in silico моделирование генерируемых ПЦР-профилей, результаты которого представлены на рис. 1.

Рис. 1. Моделирование ПЦР-профилей аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы (праймеры Wx-B1L + Wx-B1R [Wx-B2R] и 4F-c + Wx-B1R [Wx-B2R])

Обозначения: 1-3) Праймеры Wx-B1L + Wx-B1R [Wx-B2R]: 1) ПЦР-профиль Wx-B1a-аллеля (461 bp); 2) ПЦР-профиль Wx-B1b-аллеля (нет); 3) ПЦР-профиль Wx-B1e-аллеля (495 bp). 4-6) Праймеры 4F-c + Wx-B1R [Wx-B2R]: 4) ПЦР-профиль Wx-B1a-аллеля (402 bp). 5) ПЦР-профиль Wx-B1b-аллеля (нет). 6) ПЦР-профиль Wx-B1e-аллеля (436 bp).

При тестировании способа проведения ПЦР № 1 с праймерами Wx-B1L + Wx-B1R для идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы наблюдалась амплификация неспецифичных ПЦР-продуктов, негативно влияющих на анализ полученных результатов реакции (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма результата ПЦР-идентификации генотипов яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ по аллельным вариантам Wx-B1-локуса Waxy-гена (праймеры Wx-B1L + Wx-B1R)

Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp + 1,5 kb (СибЭнзим). 1-7) ПЦР-профиль Wx-B1a-аллеля. 8-9) ПЦР-профиль Wx-B1b-аллеля.

Наиболее проблемный артефакт, выявленный в ходе опытов – не свойственная заявленному способу генерация ПЦР-продукта локуса Wx-A1-аллеля длиной 491 bp (рис. 2), затрудняющего дискриминацию Wx-B1e-аллеля со схожим по длине размером (495 bp), что в конечном счете не позволяет провести корректную идентификацию аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы.

Причина неудовлетворительной работы данного способа проведения ПЦР была в конструктивной особенности аллельспецифичного праймера Wx-B1R без «mismatch-нуклеотида» в третьей позиции с 3/-конца олигонуклеотида.

Для повышения специфичности амплификационной реакции олигонуклеотидный праймер Wx-B1R был впоследствии нами реконструирован путем введения соответствующего некомплементарного «mismatch-нуклеотида» в третью позицию с 3/-конца олигонуклеотида, и переименован в аллельспецифичный праймер Wx-B2R, с дальнейшей проверкой его работоспособности в оптимизированном способе проведения ПЦР № 2.

В результате успешной апробации оптимизированного способа проведения ПЦР № 2 с праймерами Wx-B1L + Wx-B2R для идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы на образцах яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ, достоверно установлены генотипы Triticum aestivum с аллельными вариантами Wx-B1a и Wx-B1b (рис. 3); причем из 70 исследованных растений только 2 линии (Кк-8/06-6 и О-192/03-5) являлись носителями нулевого Wx-B1b-аллеля. (рис. 3, треки 8-9).

Рис. 3. Электрофореграмма результата ПЦР-идентификации генотипов яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ по аллельным вариантам Wx-B1-локуса Waxy-гена (праймеры Wx-B1L + Wx-B2R)

Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим). 1-7) ПЦР-профиль Wx-B1a-аллеля (461 bp). 8-9) ПЦР-профиль Wx-B1b-аллеля (нет).

При разработке способа проведения ПЦР для идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы руководствовались принципом усовершенствования одноименного прототипа, результаты апробации которого в контексте оптимизации общеизвестного способа генотипирования были представлены выше.

Отличительной особенностью предложенного способа проведения ПЦР от ближайшего аналога является использование вместо праймера Wx-B1F олигонуклеотида 4F-c, генерирующего, в сравнении с прототипом, редуцированные на 61 bp ПЦР-продукты длиной 402 bp (Wx-B1a-аллель) и 436 bp (Wx-B1e-аллель), с обеспечением более лучшего разделения амплифицированных фрагментов в агарозном геле и соответственно повышением точности интерпретации результатов генотипирования.

При тестировании способа проведения ПЦР № 3 для идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы с праймерами 4F-c + Wx-B1R наблюдалась амплификация неспецифичных ПЦР-продуктов, негативно влияющих на анализ полученных результатов реакции (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма результата ПЦР-идентификации генотипов яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ по аллельным вариантам Wx-B1-локуса Waxy-гена (праймеры 4F-c + Wx-B1R)

Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp + 1,5 kb (СибЭнзим). 1-7) ПЦР-профиль Wx-B1a-аллеля. 8-9) ПЦР-профиль Wx-B1b-аллеля.

Наиболее проблемным артефактом, выявленным в ходе постановки опытов, была не характерная для разработанного способа генерация ПЦР-продукта локуса Wx-A1-аллеля длиной 432 bp (рис. 4), затрудняющего дискриминацию Wx-B1e-аллеля со схожим по длине размером (436 bp), что мешает проведению корректной идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы.

Причина неудовлетворительной работы данного способа проведения ПЦР, как, впрочем, и для ранее апробированного прототипа – способа проведения ПЦР № 1, заключалась в конструктивной особенности аллельспецифичного праймера Wx-B1R, не имеющего соответствующего «mismatch-нуклеотида».

При замене же стандартного праймера Wx-B1R на модифицированный нами праймер Wx-B2R с введенным «mismatch-нуклеотидом», в оптимизированной постановке разработанного способа проведения ПЦР № 4,  удалось значительно повысить специфичность реакции (рис. 5) и обеспечить корректную идентификацию исследуемых генотипов пшеницы.

Рис. 5. Электрофореграмма результата ПЦР-идентификации генотипов яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ по аллельным вариантам Wx-B1-локуса Waxy-гена (праймеры 4F-c + Wx-B2R)

Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим). 1-7) ПЦР-профиль Wx-B1a-аллеля (402 bp). 8-9) ПЦР-профиль Wx-B1b-аллеля (нет).

Заключение

Разработанные и оптимизированные нами способы проведения ПЦР для идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы, апробированные на образцах яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ, позволили провести корректную идентификацию исследуемых генотипов Triticum aestivum с выявлением двух хозяйственно ценных линий (Кк-8/06-6 и О-192/03-5), несущих в своих геномах нулевой Wx-B1b-аллель.

Выражаем благодарность Вафину Ришаду Абдулфартовичу за оказанную финансовую поддержку.

Рецензенты:

Морозов Николай Васильевич, д.б.н., профессор кафедры биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета, г. Казань.

Багаева Татьяна Вадимовна, д.б.н., профессор, зав. кафедрой биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета, г. Казань.