Введение
Гинкго двулопастный Ginkgo biloba L. — единственный реликтовый вид класса Гинкговых (сем. Ginkgoaceae), который сохранился до нашего времени с пермского периода палеозойской эры [1, 6, 11]. Гинкго двулопастный произрастает в странах с субтропическим климатом, однако возможности к адаптации этого растения очень высоки, о чем свидетельствует его успешное культивирование в Российской Федерации, в частности, в Краснодарском, Ставропольском краях, в Московской обл. [3, 4]. Листья гинкго двулопастного (Ginkgo biloba L.) входят в Европейскую и Американскую фармакопеи, а также включены в Государственный реестр лекарственных средств РФ [1, 3, 6]. На основе субстанций из листьев гинкго двулопастного в Российской Федерации применяются такие препараты, как танакан, билобил, мемоплант, гинкор форт, гинкор гель, однако они производятся за рубежом и являются дорогостоящими. Это обусловливает актуальность исследований в плане обоснования целесообразности создания импортозамещающих ноотропных препаратов на основе листьев гинкго двулопастного. Для успешного решения данной проблемы необходимой является разработка методов стандартизации, позволяющих объективно оценивать качество сырья и лекарственных препаратов данного растения.
На данный момент в Российской Федерации отсутствуют какие-либо виды нормативной документации на сырье «Гинкго двулопастного листья», причем до сих пор не решены в полной мере вопросы стандартизации сырья и препаратов гинкго, хотя определенный опыт в этом отношении имеется [3]. На основе результатов изучения компонентного состава флавоноидов листьев гинкго двулопастного ранее была разработана методика количественного определения суммы флавоноидов с использованием дифференциальной спектрофотометрии и Государственного стандартного образца рутина [2]. В плане дальнейшего совершенствования методов стандартизации листьев гинкго двулопастного особый интерес представляют такие методы, как тонкослойная хроматография (ТСХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [3, 12].
Цель исследования – научное обоснование новых подходов к стандартизации листьев гинкго двулопастного с использованием метода ВЭЖХ.
Материал и методы исследования
В качестве объектов исследования образцы листьев гинкго двулопастного, культивируемого в различных регионах Российской Федерации: Московская обл. (Ботанический сад Института физиологии растений РАН, г. Москва), Краснодарский край (Ботанический сад г. Краснодара), Ставропольский край (окр. г. Пятигорска).
В работе использованы тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография и спектрофотомерия. Регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena). Воздушно-сухое растительное сырье подвергали исчерпывающему экстрагированию 70 % этиловым спиртом в соотношении «сырье – экстрагент» - 1:30. Анализ полученных водно-спиртовых извлечений осуществляли с помощью ТСХ на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системе хлороформ-этанол-вода (26:16:3). В качестве стандартных веществ использовали гинкгетин (7,41-диметиламентофлавон) (1), никотифлорин (3-О-рутинозид кемпферола) (2), рутин (3-О-рутинозид кверцетина) (3) и нарциссин (3-О-рутинозид изорамнетина (4) (рис. 1).
Гинкгетин (1)
Никотифлорин (2)
Рутин (3)
Нарциссин (4)
Рис. 1. Химические структуры важнейших флавоноидов листьев гинкго двулопастного.
Исследование водно-спиртовых извлечений из листьев гинкго двулопастного с помощью ВЭЖХ осуществляли с использованием хроматографа «Стайер» (ООО «НПО Аквилон», г. Подольск) и колонки размером 4,6 х 250 мм (стационарная фаза - октадецил силан С-18), объем вводимой пробы – 25 мкл. В качестве подвижной фазы использовали смеси «ацетонитрил-вода» в соотношении (70:30). Скорость подачи элюента составила 2 мл/мин. Детектирование веществ осуществляли УФ-детектором при длине волны 270 нм. Скорость подачи элюента составила 2 мл/мин. Детектирование веществ осуществляли УФ-детектором при длине волны 270 нм. Качественный анализ проводили посредством регистрации времен удерживания веществ и сравнения спектральных отношений, причем как в условиях метода внутреннего стандарта, так и путем введения растворов индивидуальных веществ в хроматографическую колонку.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты сравнительного исследования методом ТСХ свидетельствуют о том, что на хроматограммах водно-спиртовых извлечений различных образцов являются гинкгетин (1) и никотифлорин (2) (рис. 2). После проявления хроматограммы щелочным раствором диазобензолсульфокислоты гинкгетин и изогинкгетин обнаруживаются в виде доминирующего пятна желто-оранжевого цвета с величиной Rf около 0,8, а никотифлорин - в виде желтого пятна с величиной Rf около 0,6. Следует отметить, что на уровне гинкгетина обнаруживается изогинкгетин, что соответствует данным зарубежных ученых, в работах которых близкие по химической структуре флавоноиды обнаруживаются в виде одного пятна [10]. Сопоставимую хроматографическую подвижность имеют также никотифлорин и нарциссин, которые в водно-спиртовых извлечениях и в лекарственном препарате «Танакан» обнаруживаются в виде одного пятна желтой окраски с величиной Rf около 0,6.
На наш взгляд, заслуживает внимания тот факт, что во всех исследуемых образцах листьев одним из доминирующих компонентов является соединение фенольной природы с величиной Rf около 0,7, тогда как в лекарственном препарате «Танакан» оно содержится в незначительных количествах. Что касается одного из доминирующих флавоноидов листьев - гинкгетина, то это вещество в танакане не обнаруживается.
Рис. 2. Схема тонкослойной хроматограммы веществ и водно-спиртового извлечения из листьев гинкго двулопастного.
Обозначения: 1 – водно-спиртовое извлечение из сырья (Ботанический сад г. Краснодара); 2 – водно-спиртовое извлечение из сырья (Ботанический сад Института физиологии растений РАН, г. Москва); 3 – водно-спиртовое извлечение из сырья (окр. г. Пятигорска); 4 – раствор препарата «Танакан»; 5 – гинкгетин; 6 – изогинкгетин; 7 – никотифлорин; 8 – нарциссин; 9 – рутин.
Изогингетин обнаружен нами в качестве примеси в образце гинкгетина, что соответствует данным зарубежных ученых, которые получили эти соединения в виде смеси [9]. Примечательно, что и в другой зарубежной работе гинкгетин (7,41-диметиламентофлавон) и изогинкгетин (41,4111-диметиламентофлавон), будучи близкими по химической структуре, обнаруживаются в виде одного пятна [6]. На наш взгляд, определение гинкгетина как одного из доминирующих и характерных флавоноидов листьев гинкго двулопастного имеет принципиальное значение. Во-первых, для гинкгетина выявлена ноотропная активность, свойственная препаратам гинкго [4, 7, 10], а во-вторых, имеются примеры, когда стандартизацию сырья данного растения осуществляют без учета наличия гинкгетина: методом ВЭЖХ обнаруживаются лишь продукты кислотного гидролизата – кемпферол, кверцетин и изорамнетин [5], что, на наш взгляд, является ошибочным подходом. Что касается рутина, описанного в литературе для данного растения, то он относится к минорным компонентам и едва обнаруживается на хроматограммах (ТСХ). Интересно, по данным зарубежных ученых, в исследуемых образцах листьев гинкго двулопастного рутин относительно четко обнаруживается методом ТСХ лишь в сырье из Италии [8].
Учитывая то обстоятельство, что гинкгетин (1), как один из доминирующих флавоноидов, имеет диагностическое значение, на наш взгляд, ТСХ-анализ может быть использован для целей идентификации сырья и препаратов данного растения.
Результаты сравнительного исследования электронных спектров водно-спиртовых извлечений образцов листьев гинкго двулопастного, культивируемого в различных регионах России, свидетельствуют о том, что для всех образцов сырья характерен основной максимум поглощения в области 270 нм + 1 нм (рис. 3).
Гинкгетин (1), имея максимумы поглощения при 270 и 330 нм, в значительной мере определяет спектральные характеристики водно-спиртового извлечения из листьев гинкго двулопастного (рис. 3), может быть также использовано для целей идентификации сырья данного растения.
Рис. 3. Электронный спектр водно-спиртового извлечения из листьев гинкго двулопастного.
В последнее время для целей стандартизации активно внедряется метод ВЭЖХ, позволяющий одновременно осуществлять качественный и количественный анализ ЛРС. На наш взгляд, в условиях ВЭЖХ в качестве маркера может выступать доминирующий флавоноид гинкгетин (1). Результаты ВЭЖХ-анализа свидетельствуют о том, что в исследуемых условиях хроматографирования гинкгетин (1) с величиной времени удерживания около 12,5 мин хорошо отделяется от других компонентов листьев гинкго двулопастного (рис. 4), что позволяет данный метод рекомендовать как для целей идентификации листьев гинкго двулопастного, так и для целей стандартизации препаратов на основе сырья данного растения.
Рис. 4. ВЭЖХ-хроматограмма водно-спиртового извлечения из листьев гинкго двулопастного.
Учитывая специфичность гинкгетина для листьев гинкго двулопастного, считаем целесообразным использование метода ВЭЖХ для определения подлинности сырья и препаратов данного растения по обнаружению данного флавоноида, имеющего диагностическое значение. Метод ВЭЖХ имеет принципиальное значение с точки зрения создания импортозамещающих ноотропных препаратов, которые в отличие зарубежных аналогов содержат гинкгетин, обладающий ноотропной активностью и характеризующий их происхождение в силу специфичности.
Выводы
1. Разработаны новые подходы к стандартизации подхода к стандартизации листьев гинкго двулопастного, заключающиеся в комплексном использовании спектрофотометрии, ТСХ и ВЭЖХ.
2. С учетом специфичности гинкгетина для листьев гинкго двулопастного, является целесообразным использование методов ВЭЖХ и ТСХ для определения подлинности сырья и препаратов данного растения по обнаружению данного флавоноида, имеющего диагностическое значение.
Рецензенты:
Шаталаев Иван Федорович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой химии фармацевтического факультета государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г.Самара.
Правдивцева Ольга Евгеньевна, доктор фармацевтических наук, доцент кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г.Самара.