В рамках Международной программы химической безопасности (IPCS) разработан и рекомендован к применению перечень антидотов при отравлении цианидами: амилнитрит, тиосульфат натрия, нитрит натрия, 4-диметиламинофенол, гидроксикобаломин и ЭДТА-Со2+. Преимущественно парентеральный путь введения, а в ряде случаев высокая токсичность существующих антидотов цианидов, стимулируют научные изыскания по разработке малотоксичных лечебно-профилактических антидотов, предназначенных для перорального применения. В настоящей статье приводятся результаты доклинической оценки безопасности и особенностей фармакокинетики пероральной лекарственной формы лечебно-профилактического антидота цианидов на основе смешанной кобальтовой (2+) соли меркаптоуксусной и пировиноградной кислот.
Цель исследования - экспериментальная оценка токсичности, особенностей фармакокинетики и безопасности потенциального лечебно-профилактического антидота цианидов на основе смешанной кобальтовой (2+) соли меркаптоуксусной и пировиноградной кислот.
Материалы и методы исследования
При проведении исследования использовали модельный образец потенциального перорального антидота цианидов на основе смешанной кобальтовой (2+) соли меркаптоуксусной и пировиноградной кислот (таблетки 500 мг), синтез лекарственной формы которого осуществлён на стандартном оборудовании (технология синтеза апробирована в заводских условиях ФГУП НПЦ «Фармзащита» ФМБА России).
Оценку параметров острой токсичности проводили в опытах на половозрелых лабораторных животных (ЛЖ): белых крысах и кроликах при внутрижелудочном введении.
Для определения показателей острой токсичности при внутрижелудочном введении модельный образец препарата per os вводили через атравматичный металлический зонд в возрастающих дозах по Литчфилду - Уилкоксону [1]. Для достижения больших доз препарата введение осуществляли повторно с интервалом 20-30 минут в течение 4 часов. Расчеты величин медианно-летальных доз (LД50) проводили по В.Б. Прозоровскому, 1978 [2]. Контрольные животные получали аналогичные по объемам введения растворы воды для инъекций. Наблюдение за животными осуществлялось в течение 14 дней.
Фармакокинетические исследования модельного образца препарата проводили на кроликах при внутрижелудочном введении (средняя удельная доза составляла 100 мг/кг в пересчёте на активный компонент). Кровь (1,0 мл) отбирали из краевой вены уха кролика через 0.25; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 3.0; 6.0; 9.0; 14.0; 24.0 и 48.0 часа после введения препарата.
Учитывая, что анализ исследуемого соединения невозможен традиционными методами газо-жидкостной хроматографии, количественное определение соединения проводили по кобальту, молекулярная масса которого составляет около 1/5 молекулярной массы всей молекулы препарата. Для измерения использовали метод атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермическим способом атомизации. Предел обнаружения кобальта (3σ) в выбранных условиях составил 1,5 пг. Содержание кобальта в пробах находилось в рассчитанных доверительных границах, а методика его количественного определения в крови не зависела от систематических ошибок. Для описания фармакокинетики образца лекарственной формы препарата использовали стандартные показатели (Tmax - время достижения максимума концентрации; Cmax - максимальная концентрация; AUC - полная площадь под кривой в интервале 0-48 час; MRT - среднее время удерживания; Cl-общий клиренс; Vss-стационарный объем распределения; T1/2 - период полувыведения; Tэфф = AUC∞/Cmax - эффективная длительность) в их условных обозначениях, принятых в литературе, расчёт которых выполнялся модельно-независимым способом посредством метода интегральных моментов.
Для оценки подострой токсичности модельного образца препарата при внутрижелодочном введении вводили кроликам в эффективной (40мг/кг), промежуточной (200 мг/кг) и максимальной терапевтической дозах, не вызывающей гибели при однократном применении (500 мг/кг) на протяжении 5 суток. Регистрировали общее состояние, ректальную температуру, массу тела ЛЖ, потребление корма и воды, физиологические параметры, биохимические константы и данные анатомо-морфологических исследований в соответствии с требованиями нормативных документов по проведению доклинического изучения новых фармакологических веществ [3]. Полученные экспериментальные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования
Результаты оценки острой пероральной токсичности лекарственной формы тестируемого препарата свидетельствуют, что величины LD50 при внутрижелудочном введении в опытах на крысах колеблются в интервалах: от 3000±460 мг/кг (самцы) до 3100±350 мг/кг (самки); в опытах на кроликах, соответственно - 1500±120 мг/кг и 1800±220 мг/кг. Данные токсикометрии, наблюдения за ЛЖ на протяжении 14 суток в постинтоксикационном периоде острого отравления, а также динамика некропсии позволяет отнести тестируемую лекарственную форму препарата к IV классу малотоксичных лекарственных веществ, для которых диапазон доз LD50 при внутрижелудочном введении в опытах на крысах составляет 500-5000 мг/кг [5].
Подострое внутрижелудочное введение лекарственной формы потенциального антидота цианидов кроликам обоих полов один раз в сутки в течение 5 дней в дозах 40 и 200 мг/кг не влияло на внешний вид, общее состояние и поведение животных. На максимальной дозе (500 мг/кг) у большинства кроликов отмечалась заторможенность, вялость, снижение потребления корма, воды и диарея. В восстановительный период каких-либо заметных нарушений состояния или поведения по сравнению с контролем не отмечалось.
Следует отметить, что в ходе эксперимента фиксировалась гибель подопытных животных на максимальной дозе, что свидетельствовало о наличии возможного кумулятивного эффекта модельного образца потенциального антидота цианидов, что в дальнейшем было подтверждено экспериментально: отношение предполагаемой ЛД50 при повторных введениях (2000 мг/кг) к ЛД50 при однократном введении (1650 мг/кг - среднее между ЛД50 кроликов самцов и ЛД50 кроликов самок) составило ≈ 1,2, что свидетельствует о слабом кумулятивном эффекте [4].
Животные, получавшие модельный образец препарата, незначительно отставали в весе на 6 сутки исследования, однако в конце периода восстановления на 28 сутки вес кроликов опытных групп практически не отличался от веса контрольных животных. Животные опытных групп во время введения препарата потребляли корм в меньшем, а воду в большем количестве, чем в контрольных группах. В восстановительном периоде кормо- и водопотребление между всеми экспериментальными группами было одинаково.
Данные измерения ректальной температуры свидетельствуют об отсутствии различий регистрируемого показателя у животных опытных и контрольных групп. Существенных изменений со стороны выделительной функции почек при введении образца антидота кроликам не наблюдалось.
Исследуемый образец антидота в дозе 500 мг/кг вызывал у кроликов достоверно значимое увеличение частоты сердечных сокращений, снижение вольтажа зубцов Р и R, а также снижение интервалов PQ и QT. Максимальные изменения наблюдались через 30-120 минут после введения антидота. На шестые сутки и в конце восстановительного периода значимые различия между контрольными и опытными группами, также как и половые различия не зафиксированы. Дозы 40 и 200 мг/кг не влияли на частоту сердечных сокращений и характер электрокардиограммы кроликов.
Следует отметить, что у подопытных животных на 6 сутки исследования не отмечалось достоверно значимых патологических гематологических изменений, кроме незначительного увеличения гематокрита и скорости оседания эритроцитов у животных, получавших дозу 500 мг/кг. На 28 день исследования достоверных отличий между показателями контрольной и опытных групп не зафиксировано, и в конце периода наблюдения периферическая кровь кроликов всех экспериментальных групп по своему количественному и качественному составу соответствовала видовой физиологической норме.
У кроликов опытных групп на дозах 40, 200 и 500 мг/кг через 5 дней непрерывного применения препарата биохимические показатели периферической крови не выходили за пределы физиологической нормы по сравнению с фоном и контролем. Исключение составлял показатель протромбинового времени, который достоверно возрастал на 6 сутки при введении 500 мг/кг. На 28 сутки исследования достоверные отличия между исследуемыми группами по всем показателям отсутствовали.
Данные вскрытия и макроскопического исследования показали, что достоверные отличия в массовых коэффициентах органов кроликов всех экспериментальных групп отсутствуют как на 6 сутки, так и на 28 сутки восстановительного периода. При просмотре гистологических препаратов органов контрольных животных и органов животных, получавших препарат в дозах 40, 200 и 500 мг/кг, после восстановительного периода (на 28 день исследования) различий между группами не обнаружено.
Таким образом, по результатам некропсии и гистологического исследования ежедневное пероральное введение лекарственной формы антидота цианидов в дозах 40, 200 и 500 мг/кг в течение 5 суток кроликам не вызывает раздражения, воспаления или деструкции тканей желудочно-кишечного тракта, а также не сопровождается развитием дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов.
Результаты проведённого исследования фармакокинетики потенциального перорального антидота цианидов при введении кроликам в дозе 100 мг/кг (табл. 1).
Таблица 1. Показатели фармакокинетики кобальта при внутрижелудочном введении лекарственной формы препарата, 100 мг
|
№№ |
Показатель |
||||||||
|
Tmax |
Cmax |
AUC48 |
AUC 00 |
MRT |
Cl |
Vss |
T1/2 |
Tэфф |
|
|
ч |
мкг/мл |
мкг*ч/мл |
мкг*ч/мл |
ч |
л/кг/ч |
мл/кг |
ч |
ч |
|
|
1 |
1.50 |
64.32 |
862.56 |
955.11 |
15.78 |
98.16 |
1549.36 |
12.68 |
14.85 |
|
2 |
1.50 |
72.80 |
1356.59 |
1431.76 |
14.88 |
74.30 |
1105.43 |
11.58 |
19.67 |
|
3 |
1.50 |
57.41 |
747.76 |
782.91 |
13.75 |
119.75 |
1646.21 |
10.15 |
13.64 |
|
4 |
2.00 |
86.84 |
1067.00 |
1145.41 |
14.03 |
92.88 |
1302.80 |
11.09 |
13.19 |
|
5 |
1.50 |
55.77 |
711.99 |
749.43 |
13.88 |
125.09 |
1735.86 |
10.38 |
13.44 |
|
6 |
2.00 |
70.31 |
911.18 |
965.46 |
14.01 |
110.19 |
1543.33 |
10.66 |
13.73 |
|
Арифм. средн. |
1.67 |
67.91 |
942.85 |
1005.01 |
14.39 |
103.39 |
1480.50 |
11.09 |
14.75 |
|
Ошибка средн. |
0.11 |
4.69 |
97.54 |
103.36 |
0.32 |
7.68 |
95.50 |
0.38 |
1.01 |
|
Станд. откл. |
0.26 |
11.48 |
238.91 |
253.19 |
0.79 |
18.81 |
233.93 |
0.93 |
2.47 |
|
Коэф. вариац (%) |
15.49 |
16.90 |
25.34 |
25.19 |
5.51 |
18.19 |
15.80 |
8.39 |
16.77 |
|
Медиана |
1.50 |
67.32 |
886.87 |
960.28 |
14.02 |
104.17 |
1546.35 |
10.87 |
13.68 |
|
Геом. ср |
1.65 |
67.13 |
919.83 |
980.27 |
14.37 |
101.88 |
1463.87 |
11.06 |
14.60 |
Полученные данные позволяют констатировать, что наибольшая концентрация кобальта в плазме крови отмечается через 1,7 часа после введения антидота и составляет 67,91±4,69 мкл/мг; последующее снижение его концентрации характеризуется временем половинного убывания 11,09±0,38 часов. Общее время присутствия кобальта в организме составляет 14,39 ±0,32 часов. Объём распределения составляет порядка 14 л/кг.
Выводы
- Пероральная лекарственная форма образца потенциального перорального антидота цианидов по параметрам острой токсичности относится к классу малотоксичных лекарственных веществ.
- Внутрижелудочное введение кроликам модельного образца потенциального перорального антидота цианидов в дозах 40 и 200 мг/кг в условиях подострого эксперимента не влияет на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не оказывает негативного влияния на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и малой токсичности препарата. Изменения, происходящие при введении максимальной дозы антидота - 500 мг/кг, кратковременны и не регистрируются после восстановительного периода.
- Модельный образец потенциального антидота цианидов обладает слабо выраженным кумулятивным эффектом (коэффициент кумуляции - 1,2).
- При внутрижелудочном введении кроликам модельного образца потенциального антидота цианидов в дозе 100 мг/кг наибольшая концентрация кобальта в плазме крови фиксируется через 1.7 часа после введения препарата и составляет 67.91±4.69 мкг/мл; последующее снижение концентрации кобальта характеризуется временем половинного убывания, равного 11.09±0.38 часов; общее среднее время присутствия кобальта в организме составляет 14.39±0.32 часов; объем распределения - 14 литров/кг.
- Исследованная пероральная лекарственная форма потенциального антидота цианидов на основе смешанной кобальтовой (2+) соли меркаптоуксусной и пировиноградной кислоты не имеет противопоказаний для клинических испытаний и медицинского применения.
Рецензенты:
Сарманаев С.Х., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой «Токсикология и клиническая фармакология», ФГБОУ ДПО ИПК ФМБА России, г. Москва.
Образцов Н.В., д.м.н., с.н.с., профессор кафедры «Токсикология и клиническая фармакология», ФГБОУ ДПО ИПК ФМБА России, г. Москва.