Цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) широко распространена среди высших растений. Это явление заключается в неспособности растения продуцировать жизнеспособную пыльцу, тогда как женская генеративная сфера остается в норме. Различные системы ЦМС - Rf имеют принципиальное значение при производстве гибридных семян различных культур (подсолнечника, риса, сахарной свеклы, рапса и других), так как они обеспечивают проведение контролируемого опыления материнских стерильных линий пыльцой отцовских форм без трудоемкой ручной кастрации [7].

Мужская фертильность может быть восстановлена ядерными генами восстановления фертильности пыльцы Rf-генами (Restoration of fertility). К настоящему времени у подсолнечника (Helianthus annuus) описаны более 70 источников ЦМС, каждый из которых требует присутствия в геноме определенных генов восстановления фертильности. Однако все современные промышленные гибриды подсолнечника созданы на основе одного источника ЦМС РЕТ1, полученного Леклерком из межвидового гибрида H. petiolaris × H. аnnuus.  Митохондральная ДНК форм с цитоплазматической мужской стерильностью (мтДНК РЕТ1) отличается от мтДНК фертильных форм наличием инверсии 11 т.н. и инсерции 5 т.н., приводящих к появлению новой открытой рамки считывания orfH522, ко-транскрибируемой вместе с геном atpA и кодирующей белок 16 кДа. Мужской фертильный фенотип может быть восстановлен путем введения в генотип гибрида доминантного ядерного гена Rf, который вызывает снижение уровня ко-транскрипта atpA-orfH522 в пыльниках в течение мейоза и дальнейшее снижение количества белка ORFH522. По различным данным, для восстановления фертильности пыльцы форм подсолнечника с ЦМС PET1 необходимо от одного до четырех генов. Показано, что один из генов, необходимых для восстановления фертильности форм с ЦМС РЕТ1, присутствует в генотипе большинства линий ЦМС и линий-закрепителей стерильности, а другой - Rf1 - должен быть введен из линии-восстановителя [5; 6].

О наличии генов Rf в генотипе можно судить по присутствию молекулярных маркеров, тесно сцепленных с ними. Было показано, что SCAR-маркер HRG02/OPY10, разработанный Р. Хорн с сотрудниками [5], может использоваться для поиска носителей гена Rf1 [4].

Производство  гибридных семян, проявляющих эффект гетерозиса в первом поколении, - основная методика повышения урожайности, валового сбора семян с высокими технологическими качествами. Для их промышленного производства используют материнские линии с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) и отцовские формы, несущие гены-восстановители фертильности пыльцы (Rf) [2].

Большинство созданных на основе системы ЦМС-Rf  гибридов подсолнечника имеют масличное направление, тогда как кондитерскому направлению уделялось недостаточное внимание. В настоящее время существует необходимость в создании гибридов кондитерского направления отечественной селекции, так как возрастает спрос на производство кондитерского сырья.

В коллекции генетических ресурсов подсолнечника ВИР, насчитывающей  2230 образцов культурного и 630 образцов дикорастущих видов, имеется 85 линий-восстановителей фертильности пыльцы масличного направления, однако они не могут быть использованы  при создании крупноплодного гибрида, так как не соответствуют необходимым критериям (недостаточный размер семянки, высокая масличность) [2].

На данный момент крупноплодные отцовские линии-восстановители пыльцы в коллекции отсутствуют. Цель данного исследования заключалась в исследовании сортов крупноплодного подсолнечника для поиска в них генов Rf1 при помощи SCAR-маркеров с дальнейшим созданием из них отцовских линий.

Материал и методы

Материалом  исследования служили 34 образца крупноплодного подсолнечника из коллекции ВИР, включающие 30 сортов отечественной и зарубежной селекции, одну линию (ВИР479), сорт Хейлудзянский, который был разделен на 3 фенотипически различные группы, и сорт Местный-9, который также был разделен на 2 формы - ветвистую и неветвистую. Весь материал репродуцирован в условиях Кубанской опытной станции ВИР. Геномную ДНК выделяли из этиолированных проростков с использованием модифицированного СТАБ-метода [1; 3]. В экстракционный буфер вводили поливинилпирролидон (PVP) 40000 и метабисульфит натрия; для удаления РНК полученные фракции ДНК инкубировали в течение 1 ч при 37 °С в присутствии РНКазы А. Для амплификации маркерного фрагмента HRG02 использовали праймер Y10 (прямой 5΄-AAA CGT GGG AGA GAG GTG G-3΄, обратный 5΄-AAA CGT GGG  CTG AAG AAC TA-3΄). ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация при 94 °С (45 сек), отжиг праймеров при 65 °С в течение 45 сек, элонгация при 72 °С (60 сек), количество циклов 35. Реакционная смесь (25 мкл) содержала 50 нг геномной ДНК, однократный реакционный буфер 10x (1,5 мM MgCl2), по 0,4 мкМ каждого из праймеров, по 0,2 мМ каждого dNTP и 0,2 ед. Taq-полимеразы. Электрофорез проводился в 1,8%-ном агарозном геле. В опытах проанализировали в среднем по 8 растений из каждого образца.

Результаты и обсуждение

На ДНК изученных генотипов праймеры Y10 инициировали синтез фрагмента HRG02 ожидаемого размера (740 п.н.) либо не давали продуктов амплификации. В основном сорта подсолнечника демонстрировали гетерогенность по наличию-отсутствию маркерных последовательностей HRG02, что можно объяснить неоднородностью геномов сортов по сравнению с инцухт-линиями, которые представляют собой не одно поколение инбридинга.

В результате исследованные образцы крупноплодного подсолнечника были условно размещены в 4 группы в зависимости от количества растений, в геноме которых был обнаружен маркер Y10 (таблица 1). Первая группа включает образцы с наличием маркера Y10 у более половины исследованных растений, вторая группа - наличие маркера у 20-50% растений, третья - у 10-20%, у четвертой группы маркер Y10 отсутствовал.

Таблица 1. Результаты скрининга образцов коллекции с использованием SCAR-маркера локуса Rf1

Примечание: * - количество растений, в геноме которых был обнаружен маркер Y10, выраженное в процентном соотношении от общего числа проанализированных растений данного сорта.

Из полученных данных можно сделать вывод о наличии у большинства исследованных сортов в геноме гена Rf1, так как лишь у 8 из 34 образцов маркер Y10 отсутствовал полностью. У 9 сортов: и-610064, Хейлудзянский-1, Китай; к-2676, Украина; и-610067, с. 03002, Китай; к-2801, Приморский край; б/к, Северная Дакота, США; к-3583, с. Местный-9, Аргентина (ветвистый); к-3583, с. Местный-9, Аргентина (неветвистый); к-3578, с. Местный-2, Украина; к-2664, Приморский край наличие маркера Y10 выявлено более чем у 60% проанализированных растений каждого образца. Причем необходимо отметить, что среди выявленных образцов присутствуют сорта как отечественной, так и зарубежной селекции.

Среди изученных образцов, в настоящий момент районированы кондитерские сорта подсолнечника - СПК, Лакомка, Донской крупноплодный, Бородинский. В сортах СПК, Донской крупноплодный и Бородинский в геноме половины исследованных растений каждого образца обнаружен маркер гена Rf1, в сорте Лакомка маркер Y10 присутствовал у 4 из 12 растений, это особенно важно, так как эти образцы имеют особенно ценные качества. Из данных сортов возможно создание отцовских линий-восстановителей фертильности пыльцы и в будущем гибрида кондитерского направления.

Для подтверждения достоверности данных молекулярно-генетического анализа необходимо провести гибридологический анализ в полевых условиях, причем образцы, показавшие полное отсутствие маркера Y10, в анализ не будут включены, что значительно сократит объем проводимых исследований. Также необходимо увеличить количество индивидуальных скрещиваний у сортов с незначительным процентным содержанием маркера гена Rf1 для повышения вероятности обнаружения растения, несущего интересуемый ген.

Таким образом, имеется потенциальная возможность создать отцовские линии-восстановители фертильности пыльцы кондитерского направления из образцов крупноплодного подсолнечника генетической коллекции ВИР им. Вавилова.

Работа частично поддержана РФФИ (проект № 12-04-00329).

Рецензенты:

Демурин Я.Н., д.б.н., профессор, заведующий лабораторией генетики ГНУ «ВНИИМК Россельхозакадемии», г. Краснодар.

Колясникова Н.Л., д.б.н., доцент, зав. кафедрой ботаники и генетики, физиологии растений и биотехнологий, ФГБОУ ВПО «Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова», г. Пермь.