Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Целью настоящего исследования явилось определить частоту мутаций у пациентов с  муковисцидозом (МВ) в Чувашии.

Материалы и методы

В ЧР Центр по диагностике, лечению и реабилитации больных МВ создан в 2007 году, куда включены данные 92 пациентов с МВ, наблюдаемых с 1982 года. На настоящий момент в ЧР наблюдается 51 больной: 32 ребенка на базе БУ «Республиканская детская клиническая больница» (г. Чебоксары) и 19 взрослый на базе БУ «Республиканская клиническая больница» (г. Чебоксары). 

Для определения частоты МВ были проанализированы данные рождаемости и диагностики МВ после всех этапов неонатального скрининга за 2006-2012гг. Диагноз  МВ был установлен на основании клинической картины, данных положительной потовой пробы и/или генетического исследования.

Проведен ретроспективный анализ медицинской документации, включая амбулаторные карты и выписки из стационаров. Оценивались следующие показатели: возраст установления диагноза, уровень хлоридов пота при диагностике МВ, наличие внелегочных и легочных осложнений, результаты молекулярно-генетического исследования, этиологию флоры респираторного тракта. Среди показателей функции внешнего дыхания учитывались ОФВ₁ (объем форсированного выдоха за первую секунду) и ФЖЕЛ (форсированная жизненная емкость легких) как процент от должных величин. Спирометрия проведена у всех взрослых пациентов и у 18 детей старше 6 лет на аппаратах Shiller SP-10 или Master Screen Body по стандартной методике. Потовый тест был проведен всем пациентам двукратно с помощью экспресс-методики с помощью аппарата Нанодакт (Вескор, США) и/или определением хлоридов пота по методу Гибсона-Кука. 

Молекулярно-генетические исследование проведено 38 пациентам (74,5%) в лаборатории ДНК диагностики ГУ МГНЦ РАМН, (г. Москва). Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью набора реактивов для выделения DNAPrep100 (DIAtom^тм, Россия) по протоколу производителя. Определялась аллельная частота всех выявленных мутаций и идентифицировалась «тяжесть» генотипа: под тяжелым «тяжелым» подразумевалось обязательное наличие в генотипе мутации I-III класса, под «мягким» - хотя бы одной мутации IV-V классов.

Микробиологическое исследование мокроты (мазок из зева, мокрота, орофарингеальный смыв) проведено в бактериологической лаборатории Городского Центра Диагностики (г.Чебоксары) с помощью селективных сред или в бактериологических лабораториях 57 и 15 городских  клинических больницах г. Москвы. Под хроническим инфицированием дыхательных путей грамотрицательной флорой  принималось  наличие  ее в более чем 50% образцов  мокроты  при условии не менее 4х посевов за последние 12 месяцев: критерии центра МВ в г. Лидс (Великобритания).

Статистическая обработка проведена с помощью пакета прикладных программ SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL). В зависимости от вида распределения мерами центральной тенденции и рассеяния служили среднее значение (М) ± стандартное отклонение (SD)  или медиана (Ме) (интерквартильный размах). При сравнении средних значений или медиан применялись t-критерий Стьюдента или критерий Манна-Уитни. Для оценки различий категориальных переменных в подгруппах использовался χ² или точный метод Фишера. Для оценки выживаемости в анализ включены данные 26 пациентов, умерших за период 1993 по 2012 гг. Выживаемость оценивалась с помощью анализа Каплана-Майера. Различия считали статистически значимыми при p<0,005.

Результаты и обсуждение

В данной работе впервые проведен анализ генетических особенностей МВ в Чувашской республике, течения заболевания в разные возрастные периоды. В литературе доступны показатели московского региона [3,4] и Ярославской области [1]. Однако, доминирование чувашской национальности в Чувашской Республике повлияло на формирование определенных особенностей муковисцидоза в данном регионе.

Данные диагностики с помощью неонатального скрининга представлены в табл.1. 

Таблица 1

Показатели диагностики муковисцидоза при проведении неонатального скрининга в ЧР

Показатели неонатального скрининга в Чувашии сопоставимы с данными других центров и варьируют с небольшим разбросом в пределах 1:8000, что не противоречит ранее полученным данным о примерной частоте МВ на территории РФ 1:10000 [5]. Учитывая «потери» на каждом их этапов скрининга, в том числе и в Чувашии, реальная частота МВ должна быть несколько выше и приближается к 1:6500 [5]. 

Возраст самого младшего больного на август 2013 года был равен 7 мес., самого старшего - 30,4 года, средний возраст составил 14,6 ± 9,3г, медиана возраста 15,0 (18,1) лет. Количество пациентов старше 18 лет в ЧР 19 человек (37,3%). Диагноз МВ устанавливался в среднем в возрасте 5,7 ± 6,6 лет (медиана 1,6 (11,3) лет).

При генетическом обследовании выявлены следующие генотипы: E92K/E92K, E92K/F508del, F508del/F508del, E92K/W401X, E92K/N1303K, Е92К/CFТRdel1-11, F508del/unknown, Е92К/unknown и unknown/ unknown. Аллельная частота мутаций представлена в табл. 2.

Таблица 2

Аллельная частота мутаций среди  больных муковисцидозом в Чувашии (N=76)

Примечание: N-общее число аллелей

Общая доля выявленных аллелей составила 85,5%. Встречаемость E92K среди всех генотипов cоставила 76,3 %, а F508del - 44,7%.  Среди 34 генотипов, среди которых можно определить «тяжесть», у 29 (85,3%) выявлялся «мягкий» генотип и только у 5 (14,7 %) - «тяжелый».

       Мутация E92K (p. Glu92Lys, c.274G>A) ассоциирована с распространенностью у тюркских народов [7], но ни в одном этносе или в географическом регионе мира такой высокой аллельной частоты ее до настоящего момента не выявлялось. Кроме того, ряд других мутаций, преимущественно встречающихся в  определенных народностях зарегистрированы  в соответствующих этносах с гораздо меньшей частотой, чем Е92К у чувашей [6].  Распространенность «этнической» мутации E92K почти в два раза превышает частоту самой частой мутации в мире - F508del, в то время, как ни в одном регионе мира, где регистрируется это нозология, такого соотношения ранее не отмечалось. Необходимо отметить, что в обследуемой группе есть 5 пациентов (три гомозиготы по F508del, одна гетерозигота по F508del и неизвестной  мутации, один больной с обеими не выявленными мутациями) семьи которых являлись переселенцами из европейской части страны, и по этнической принадлежности, не отмечавшие в родословной чувашские корни. Открытие E92K, как частой мутации в Чувашии, продиктовало включение ее в спектр генетической панели рутинно обследуемых мутаций Медико-генетического Научного Центра РАМН. Это в свою очередь позволило верифицировать E92K в других регионах страны, где она была обнаружена в достаточном количестве, так аллельная частота в Москве и Московской области составила 1,4%, [3],  в ярославском регионе - 0,94%.[1].

 Другой важной особенностью генетического профиля обследованной группы явилось относительно малое число выявленных мутаций: Е92К, F508del, N1303K, W401X, СFTRdele1-11 cуммарная аллельная частота которых очень высокая - 85,5 %, за счет доминирования E92K и F508del (на их долю приходится 81,6%), в то время как в других этносах и странах представительство мутаций МВ  намного более разнообразное, а общее число мутаций  в мире уже насчитывает около 2000 [7]. Это обстоятельство объясняется достаточно генетической однородностью,  и в том числе значительным преобладанием мутации E92K среди чувашских больных.  «Тяжелые» мутация W401X и СFTRdele1-11 ранее на территории России не описаны и, можно предположить, что они, возможно, тоже будут встречаться с большей частотой среди чувашских больных.

Значительное доминирование E92K  определило клиническую картину МВ в обследуемой группе. Как известно, клинические эффекты мутаций определяются механизмом генетической «поломки» (сдвиг рамки считывания, стоп-мутация, миссенс-замена, крупная делеция или инсерция),  в связи с этим замена глутаминовой аминокислоты на лизин в 4 экзоне, который кодирует соответствующий трансмембранный домен белка муковисцидозного трансмембранного регулятора, приводит к его незначительной дисфункции [2]. Органом-мишенью, дифференцирующим «тяжесть» мутаций на «мягкие» и «тяжелые» является поджелудочная железа, «мягкие» мутации не приводит к ее поражению, или панкреатическая недостаточность развивается очень поздно, а «тяжелые» мутации - к раннему развитию панкреатической недостаточности.

E92K - «мягкая» мутация [7], а известный эффект доминирования «мягкой» мутации над «тяжелой» привел к формированию подавляющего числа «мягких» генотипов в исследованной группе. Эффект протективного влияния «мягких» мутаций на функцию поджелудочной железы формирует предположение о том, что, возможно, реальная частота МВ при проведении неонатального скрининга в Чувашии занижена, в связи с тем, что  в основе этого метода лежит детекция концентрации иммунореактивного трипсина, образовавшегося в результате аутолиза ткани поджелудочной железы внутриутробно. В подтверждение этой гипотезы проведенная недавно работа Кусовой З.А. выявила, что одной из причин ложноотрицательного скрининга являлось наличие «мягкого» генотипа [5].     

 Сравнительный анализ частоты различных осложнений среди взрослых и детей представлен в табл. 3.

Таблица 3

Частота различных легочных и внелегочных осложнений

Примечание: НП - не применимо

Значительно меньшее число осложнений со стороны органов пищеварения, таких как цирроз печени с портальной гипертензией, отсутствие сахарного диабета и меконеального илеуса, также являлось следствием значительного превалирования в обследованной группе «мягких» генотипов.  Относительная  гиподиагностика МВ в детском возрасте, в том числе возможный  «пропуск» «мягких» генотипов с E92K при неонатальном скрининге и запоздание диагностики по симптомам из-за отсутствия панкреатической недостаточности, сформировала относительно высокую долю взрослых больных в обследуемой группе.  Протективное действие «мягкой» мутации на выживаемость больных явилось дополнительным фактором, влияющим на долю пациентов старше 18 лет.

С первых недель жизни ребенка, больного МВ, происходят изменения со стороны бронхолёгочной системы в виде гипертрофии бронхиальных слизистых желез и гиперплазии бокаловидных клеток. В результате этих ранних изменений развивается обтурация периферических дыхательных путей, что приводит к нарушению механизма самоочищения бронхов. В условиях мукостаза и бронхиальной обструкции у детей с МВ в нижние отделы респираторного тракта проникает большое количество патогенных микроорганизмов. Развитие хронической синегнойной инфекции нижних дыхательных путей сопровождается нарастанием респираторной симптоматики и прогрессивным ухудшением функции легких. Необходимо отметить относительно высокую долю инфицирования респираторного тракта P.aeruginosa, что, вероятно, обусловлено приверженностью к лечению в стационаре.  С другой стороны, малая доля больных с инфекцией В.сepacia говорит о достаточной сегрегации больных и успешных профилактических мероприятиях, направленных на перекрестное инфицирование.

Частота инфицирования дыхательных путей различной флорой представлена в табл. 4.

Таблица 4

Этиологическая структура патогенов по данным бактериологического исследования у  больных муковисцидозом в Чувашии

Примечание:  здесь и далее - доли больных представлены  от общего числа больных в каждой группе 

У большинства больных отмечалась  монокультура S. aureus  либо Р.aeruginosa, у 9 больных (17,7%) высеивалась микст-инфекция вышеупомянутых микроорганизмов. P. аeruginosa высеивалась как в монокультуре, так и в сочетании с другими микроорганизмами у 24 больных (47,1%).  Также встречалась хроническое или интермиттирующее инфицирование дыхательных путей следующими микроорганизмами: Klebsiella pnemoniae, Serracia liquefaciens, Sphingomonas paucimobilis, Pseudomonas putida, Streptococcus piogenes, Streptococcus epidermidis.  Наряду с бактериальной флорой у 19 больных (37,3 %) отмечался высев грибов рода Candida. 

В общем по группе ОФВ₁ и ФЖЕЛ составили 67,3 ± 25,6 и 78,1±21,1% от должного, соответственно.  Средние показатели ОФВ1 и ФЖЕЛ у взрослых составили 50,6 ± 23,7 и 66,2  ± 23,5 % от должного, соответственно, что достоверно ниже чем у детей, где они были равны 80,9 ± 18,2 и 87,9 ± 18,1% от должного, соответственно (р<0,001 и  p=0,007).

Анализ выживаемости: за период 1993-2012гг умерло 26 пациентов со средним возрастом смерти 7,4 ± 7,9лет, медиана выживаемости за обозначенный период составила 25,1г.

Выводы:

1. Особенностью генетического профиля больных муковисцидозом в Чувашской республике является наличие ограниченного числа мутаций муковисцидоза со значительным преобладанием «мягкой» мутации E92K.
2. Доминирование «мягких» генотипов среди больных в Чувашской республике определило более позднюю диагностику заболевания, значительно меньшее число осложнений со стороны органов пищеварения и относительно высокую долю взрослых больных.

Рецензенты:

Бушуева Э.В., д.м.н., профессор кафедры педиатрии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова», г. Чебоксары;

Кириллов А.Г., д.м.н., доцент кафедры педиатрии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова», г. Чебоксары.