В России частота ЖКБ колеблется от 5 до 20%, а симптоматическая форма этого заболевания (хронический калькулезный холецистит - ХКХ) является наиболее распространенной причиной острой хирургической патологии. Каждый 10-ый мужчина и каждая 5-ая женщина страдают ЖКБ [2].
ЖКБ в настоящее время рассматривается как многофакторное и многостадийное заболевание. Существует целый ряд факторов, приводящих к образованию конкрементов в желчном пузыре и в желчных протоках: избыточная масса тела, возраст, женский пол, ятрогенные факторы и др. [1]. Значимую роль в формировании ЖКБ играют генетические факторы. В ряде иностранных исследований показана роль отдельных генетических полиморфизмов, участвующих в регуляции воспаления, клеточной пролиферации, метаболизма липидов и желчных кислот в формировании ЖКБ [5, 6]. Среди генов-кандитатов, регулирующих преимущественно процессы воспаления, важное значение имеют интерлейкины. Интерлейкины представляют собой группу полипептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции защитных реакций организма. Им принадлежит важная роль в развитии и течении различных заболеваний, в том числе и органов пищеварения. Интерлейкины, взаимодействуя со специфическими рецепторами, являются одними из главных звеньев в воспалительном каскаде при ЖКБ, изменяя интенсивность и длительность воспалительных, склеротических и литогенных процессов в желчном пузыре [4].
Цель исследования: изучение роли сочетаний генетических полиморфизмов -889Т/С IL-1А, -511С/Т IL-1В, -584С/Т IL-4, -703С/Т IL-5, -174G/С IL-6, -251А/Т IL-8, -113Т/М IL-9, -592С/А IL-10 в формировании ХКХ.
Материалы и методы: группу исследования составили 544 человека: 250 больных ХКХ и 294 человека популяционного контроля. В выборки больных и популяционного контроля включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Среди 250 больных ХКХ мужчин было 42 человека (16,80%), женщин - 208 (83,20%). В популяционной выборке (294 человека) распределение по полу было аналогичным: мужчины - 50 человек (17,00%), женщины - 244 (83,00%). Средний возраст больных составил 54,66±13,08 лет (варьировался от 23 до 85 лет), популяционной выборки - 48,20±6,28 лет (варьировался от 18 до 79 лет). Таким образом, группа популяционного контроля не отличалась от группы больных по полу, возрасту, национальности и месту рождения.
Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 4-5 мл, взятая из локтевой вены пробанда. Забор венозной крови осуществлялся в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0).
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществлялось методом фенольно-хлороформной экстракции в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляли
25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивали и центрифугировали при 4ºС, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензировали. Затем прибавляли 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубировали образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производили отбор водной фазы. ДНК осаждали из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяли в бидистиллированной, деионизованной воде и хранили при -200С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Генотипирование ДНК-маркеров производилось методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием соответствующих ферментов рестрикции производства фирмы «Сибэнзим» (Новосибирск) (локусы -889Т/С IL-1А, -511С/Т IL-1В, -703С/Т IL-5, -113Т/М IL-9, -592С/А IL-10).
Генотипирование локусов -590C/T IL-4, -174G/C IL-6, -251А/Т IL-8 осуществлялось методом детекции TagMan зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе IQ5 c детектирующей системой в режиме реального времени. Для дискриминации аллелей использовалось программа «Bio-Rad IQ5-Standart Edition».
Ассоциации аллелей и генотипов с качественными признаками ХКХ оценивали с помощью показателя отношения шансов (ОR).
Для сравнения частот аллелей и генотипов между различными группами использовали критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность.
С целью решения проблемы множественных сравнений, связанной с получением ложноположительных результатов (ошибка 1-го рода), использовали пермутационный тест.
Результаты
При проведении сравнительного анализа распределения генетических полиморфизмов -889Т/С IL-1А, -511С/Т IL-1В, -584С/Т IL-4, -703С/Т IL-5, -174G/С IL-6, -251А/Т IL-8, -113Т/М IL-9, -592С/А IL-10 в исследуемых выборках установлена более высокая частота аллеля -511Т IL-1В (43,21%) и генотипа -511ТТ IL-1В (21,72%) и низкая концентрация генотипа -511СС IL-1В (35,29%) среди больных ХКХ по сравнению с контрольной группой, где анализируемые показатели составили 30,85% (χ2=14,43, p=0,001); 11,49% (χ2=7,95, p=0,01) и 49,79% (χ2=9,19, p=0,003) соответственно. Таким образом, наличие аллеля -511Т IL-1В (OR=1,71) и генотипа -511ТТ IL-1В (OR=2,14) повышает риск развития хронического калькулезного холецистита, а наличие генотипа -511СС IL-1В является протективным фактором в формировании данной патологии (OR=0,55). По другим рассматриваемым генетическим полиморфизмам достоверных различий в частотах аллелей и генотипов не обнаружено (р>0,05).
В результате анализа носительства комбинаций аллелей и генотипов исследуемых локусов интерлейкинов установлен ряд достоверных отличий больных от группы контроля. В формировании значимых сочетаний генетических вариантов, отличающих больных ХКХ от контрольной группы участвуют 5 полиморфизмов (-889Т/С IL-1А, -511С/Т IL-1В, -703С/Т IL-5, -174G/С IL-6, -113Т/М IL-9) из 8 рассмотренных.
Стоит отметить, что из восьми полученных сочетаний, имеющих ключевое значение для формирования ХКХ, семь определяют повышенный риск развития данного заболевания и лишь одно обладает протективным действием.
Установлено, что в формировании двух комбинаций, определяющих повышенный риск развития ХКХ, принимают участие по три генетических варианта исследуемых локусов интерлейкинов. Сочетания -889Т IL-1А, -511Т IL-1В и -113Т IL-9; -889Т IL-1А, -511Т IL-1В и -703С IL-5 наблюдаются у 63,37% и 62,84% больных ХКХ, тогда в группе контроля у 40,23% (ОR=2,57; 95% CI 1,54-4,3) и 44,17% (ОR=2,14; 95% CI 1,39-3,28) соответственно.
В состав оставшихся пяти комбинаций, являющихся факторами повышенного риска развития ХКХ, входят по два генетических маркера. Сочетания -511Т IL-1В и -113Т IL-9; -889Т IL-1А и -511Т IL-1В отмечаются у 65,37% и 62,67% пациентов с ХКХ, а в контрольной группе лишь в 43,82% (ОR=2,42; 95% CI 1,45-4,02) и 47,19% (ОR=1,88; 95% CI 1,29-2,74) случаев соответственно. Частота сочетаний -511Т IL-1В и -703С IL-5; -174С IL-6 и -703ТС IL-5; -113ТТ IL-9 и -703С IL-5 среди больных ХКХ в 1,5 раз выше (64,52%; 35,27% и 74,49%), чем в группе контроля: 47,59% (ОR=2,0; 95% СI 1,31-3,07); 24,0% (ОR=1,73; 95% СI 1,12-2,66); и 55,32% (ОR=2,35; 95% CI 1,22-4,56) соответственно.
Сочетание двух генетических маркеров -113М IL-9 и -703С IL-5, которое наблюдается у 19,39% больных ХКХ и у 38,3% популяционного контроля, является протективным фактором развития данного заболевания (ОR=0,39; 95% CI 0,2-0,77).
Выводы: обобщая полученные данные, можно заключить, что изученные полиморфные маркеры играют важную роль в развитии хронического калькулезного холецистита. Причем наличие у пациентов аллеля -511Т IL-1В и генотипа -511ТТ IL-1В, а также комбинаций генетических маркеров: -889Т IL-1А, -511Т IL-1В и -113Т IL-9; -889Т IL-1А, -511Т IL-1В и -703С IL-5; 511Т IL-1В и -113Т IL-9; -889Т IL-1А и -511Т IL-1В; -511Т IL-1В и -703С IL-5; -174С IL-6 и -703ТС IL-5; -113ТТ IL-9 и -703С IL-5 обуславливает повышенный риск развития ХКХ. А наличие генотипа -511СС IL-1В и сочетания генетических вариантов -113М IL-9 и -703С IL-5 обладает протективным действием. Это согласуется с литературными данными, свидетельствующими о значимой роли генов интерлейкинов в патогенезе ХКХ.
Рецензенты:
Чурносов М.И., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой медико-биологических дисциплин, медицинский факультет, ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», г. Белгород;
Сорокина И.Н., д.м.н., доцент, профессор, заведующий кафедрой медико-биологических дисциплин, медицинский факультет, ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», г. Белгород.