Изучение генетического разнообразия и внутривидовой дифференциации лесообразующих видов хвойных, в том числе и видов рода Larix, имеющих важное биосферное и ресурсное значение, является одной из важнейших задач популяционной биологии. Только на основании точных сведений о генетической структуре популяций хвойных, уровне их генетической изменчивости и характере ее распределения в пределах ареалов видов может быть оценен генетический потенциал видов и разработан для каждого из них комплекс мероприятий, направленных на максимальное сохранение генетического разнообразия в процессе их использования и воспроизводства [1]. Генетическое разнообразие лиственницы сибирской на Урале изучалось В.Л. Семериковым на основании полиморфизма цитоплазматических маркеров и частично ядерных генов [7]. Однако полиморфизм межмикросателлитных молекулярных маркеров в геноме этого вида до настоящего времени не был исследован, в том числе в популяциях L. sibirica Пермского края.
Цель данной работы – выявление полиморфизма ISSR-PCR маркеров, параметров генетического разнообразия и генетической структуры семи популяций лиственницы сибирской на Урале.
Материал и методы
В 2009-2014 гг. было изучено семь популяций Larix sibirica Ledeb (семейство Pináceae). Шесть из изученных популяций находятся в Пермском крае: две популяции являются природными и расположены в равнинных областях (Ls1 около пос. Полазна в центральной части края, Ls2 около г. Оса на юго-западе края); две популяции являются искусственными насаждениями (Ls4 на территории ООПТ «Парковый» Очерского района в западной части Пермского края, заложены известным лесоведом Ф.А. Теплоуховым; Ls5 в Кишертском районе на территории учебно-научной базы «Предуралье» в восточной части края); две популяции расположены на северо-востоке края в заповеднике «Вишерский» в горно-лесном поясе западного склона Уральских гор (Ls6 на западном склоне хребта Тулымский камень, Ls7 на правом берегу р. Таборная). В Свердловской области около пос. Билимбай в зоне низкогорной тайги находится еще одна природная популяция L. sibirica (Ls3). Она интересна тем, что расположена с восточной стороны Уральских гор.
Для молекулярно-генетического анализа в каждой популяции была собрана хвоя с 28-32 деревьев примерно одного возраста, расстояние между деревьями составляло не менее 80 м. Наименьшее расстояние между популяциями – 50 км, среднее расстояние между популяциями – 200 км. Полиморфизм ДНК проанализирован у 205 отдельных деревьев. ДНК выделяли из 20 мг высушенной хвои с использованием СТАВ-метода с добавлением в качестве сорбента PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) [5]. Концентрацию и спектральные характеристики ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo scientific, USA). Тотальная ДНК была разбавлена до рабочей концентрации 10 нг/мкл. Молекулярно-генетический анализ проведен с использованием ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats) - метода анализа полиморфизма ДНК [10]. Анализ эффективности произведен у 20 ISSR-праймеров по методике, предложенной Р.Н. Календарем и С.В. Боронниковой [2] по шкале от 1 (низкая) до 5 (самая высокая). Реакционная смесь для ISSR-ПЦР объемом 25 мкл содержала: 2 единицы Tag-полимеразы, 2,5 мкл стандартного 10х ПЦР-буфера, 25 пМ праймера, 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мM dNTP, 5 мкл геномной ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере GeneAmp PCRSystem 9700 (Applied Biosystems, USA) по типичной для ISSR-метода программе: предварительная денатурация 94 °C, 2 мин.; первые пять циклов 94 °С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72 °С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94 °С, 5 сек.; tо отж., 5 сек.; 72 °С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72 ºС. Температура отжига в зависимости от G/С-состава праймеров варьировала от 56 до 64 °С. В качестве отрицательного (К-) контроля в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,7%-ном агарозном геле. Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100bp+1.5+3Кb DNA Ladder, ООО «СибЭнзим-М», Москва). Компьютерный анализ полиморфизма ДНК проведен с помощью программы POPGENE 1.32 и специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel. Для описания генетической структуры популяций L. sibirica были использованы следующие параметры [8]: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT) во всей популяции как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HS) в субпопуляции как мера ее внутрипопуляционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций (GST). Генетическое расстояние (D) между популяциями определено по формуле M. Нея и В. Ли [9].
Результаты и их обсуждение
Каждый из 20 ISSR-праймеров был индивидуально проанализирован в ПЦР с геномной ДНК L. sibirica. В результате для данного вида отобраны 5 эффективных ISSR-праймеров, они выявляли наибольшее число четко амплифицирующихся и стабильно воспроизводящихся фрагментов ДНК: M3 [(AC)8CT], M9 [(ACC)6G], X10 [(AGC)6C], ISSR-8 [(GAG)6C], CR-215 [(CA)6GT]. Из них 2 праймера являются динуклеотидными, а 3 праймера - тринуклеотидными, так называемые якорные нуклеотиды отмечены как одно-, так и двунуклеотидные.
В семи популяциях L. sibirica было детектировано 119 ISSR-PCR маркеров, из которых 116 были полиморфными (
=0,974). В среднем один ISSR-праймер инициировал у L. sibirica синтез 17,1 фрагментов ДНК (рис. 1).
Рис. 1. ISSR-спектр популяции Ls1 с праймером Х10. М – маркер молекулярного веса,
1-4 – номера проб ДНК, стрелками обозначены некоторые полиморфные фрагменты.
Доля полиморфных локусов выше в популяции Ls5 (=0,830), ниже в Ls2 (=0,479). Из 119 ISSR-маркеров 14 (11,8%) являются уникальными, они представлены только в одной популяции, а 105 ISSR-маркеров (88,2%) являются общими для всех семи исследованных популяций. При сравнении доли полиморфных локусов по критерию Фишера популяция Ls5 имеет значимые отличия от всех остальных популяций (F>Fst=1,96). Также значимая разница по этому показателю обнаружена между популяцией Ls2, популяциями Ls1 и Ls4. Самой распространенной мерой генетической изменчивости в популяции является гетерозиготность. Ожидаемая гетерозиготность (
) на общую выборку составила 0,125 (табл. 1). Этот показатель наибольший в популяции Ls5 (HE = 0,168), а наименьший – в популяции Ls2 (HE =0,074), данные значения достоверно отличаются (F=2,149>Fst=1,96) при использовании критерия Фишера.
Таблица 1
Генетическое разнообразие изученных популяций L. sibirica
|
Популяции/ показатели |
Ls1 |
Ls2 |
Ls3 |
Ls4 |
Ls5 |
Ls6 |
Ls7 |
На выборку |
|
P95 |
0,605 |
0,479 |
0,554 |
0,638 |
0,830 |
0,558 |
0,487 |
0,974 |
|
HE |
0,121 (0,117) |
0,074 (0,013) |
0,124 (0,017) |
0,157 (0,017) |
0,168 (0,015) |
0,135 (1,018) |
0,093 (0,015) |
0,125 (0,008) |
|
na
|
1,369 (0,484) |
1,268 (0,445) |
1,352 (0,479) |
1,470 (0,501) |
1,630 (0,484) |
1,386 (0,489) |
1,285 (0,453) |
2,000 (0,000) |
|
ne
|
1,207 (0.341) |
1,119 (0.257) |
1,208 (0,326) |
1,260 (0,340) |
1,256 (0.285) |
1,232 (0,349) |
1,159 (0,308) |
1,442 (0,321) |
|
R |
2 |
0 |
0 |
1 |
10 |
0 |
1 |
14 |
Примечание: P95 – доля полиморфных локусов, HE – ожидаемая гетерозиготность, na – абсолютное число аллелей на локус; ne - эффективное число аллелей на локус, в скобках даны стандартные отклонения; R – число редких аллелей; жирным шрифтом выделены максимальные, а подчеркиванием – минимальные значения.
Для характеристики генетической структуры популяций важны также редкие, то есть встречающиеся с частотой менее 5% маркеры. В изученных популяциях L. sibirica выявлено 14 редких ISSR-PCR маркеров. Наибольшее число редких аллелей (R =10) отмечено в популяции Ls5 (рис. 2).
Рис. 2. Выявленные ISSR-PCR маркеры и ожидаемая гетерозиготность в изученных популяциях L. Sibirica.
Абсолютное число аллелей выше (табл. 1) в популяциях Ls5 (
=1,630) и Ls4 (=1,470). Эффективное число аллелей оказалось наибольшим в популяции Ls4 (
=1,260) и близко по значению в популяции Ls5 (=1,256). Этот показатель достоверно ниже в двух популяциях Ls2 (=1,119) и Ls7 (=1,159). Полученные нами данные согласуются с приведенными в литературе показателями генетического полиморфизма по ISSR-PCR маркерам для хвойных видов растений. Так, для ели гибридной доля полиморфных локусов в популяциях составляет 0,970, абсолютное и эффективное число аллелей также близки к таковым для лиственницы сибирской (na=1,970 и ne=1,463) [6]. У сосны обыкновенной [3; 4] отмечена меньшая доля полиморфных локусов (0,940) по сравнению с изученными нами популяциями L. sibirica. Эффективное число аллелей в популяциях сосны обыкновенной (ne=1,405) близко к значениям, установленным для других хвойных видов растений.
При сравнении трех групп популяций L. sibirica (искусственные насаждения, природные равнинные популяции, природные горные и предгорная популяции) доля полиморфных локусов достоверно выше в группе популяций искусственного происхождения (P95=0,848) по сравнению с группами природных популяций (F=4,8>Fst=1,96). Однако другие показатели генетического разнообразия (HE =0,223; ne =1,368) выше в группе горных и предгорной популяций данного вида (табл. 2). Значимо наиболее низкие показатели генетического разнообразия установлены в природных популяциях, расположенных в равнинных частях Пермского края (P95=0,563; HE =0,169; ne =1,284).
Таблица 2
Генетическое разнообразие трех групп популяций L. sibirica
|
Популяции/ показатели |
Природные равнинные (Ls1, Ls2) |
Искусственные насаждения (Ls4, Ls5) |
Природные горные и предгорная (Ls3, Ls6, Ls7) |
|
P95 |
0,563 |
0,848 |
0,756 |
|
HE |
0,169 (0,018) |
0,214 (0,014) |
0,223 (0,017) |
|
ne |
1,284 (0,352) |
1,329 (0,289) |
1,368 (0,353) |
Примечание: P95 – доля полиморфных локусов, HE – ожидаемая гетерозиготность, na – абсолютное число аллелей на локус; ne - эффективное число аллелей на локус, в скобках даны стандартные отклонения; жирным шрифтом выделены максимальные, а подчеркиванием – минимальные значения.
Анализ генетической структуры изученных популяций L. sibirica показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT) на общую выборку составила 0,273, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции по всем локусам (HS) равна 0,125. Коэффициент подразделенности популяций показывает, что на межпопуляционную компоненту приходится 54,35% всего генетического разнообразия (табл. 3). Наибольшая дифференциация между популяциями L. sibirica установлена с использованием праймера X10.
Таблица 3
Генетическая структура изученных популяций L. sibirica
|
ISSR-праймер |
HT |
HS |
GST |
|
M3 M9 Х10 ISSR-8 CR-215 |
0,285 (0,023) 0,308 (0,025) 0,249 (0,036) 0,296 (0,030) 0,265 (0,035) |
0,162 (0,012) 0,147 (0,006) 0,080 (0,005) 0,130 (0,006) 0,117 (0,006) |
0,432 0,521 0,681 0,559 0,557 |
|
На общую выборку |
0,273 (0,024) |
0,125 (0,008) |
0,543 |
Примечание: HT – общее генное разнообразие; HS – внутрипопуляционное разнообразие; GST – показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения.
Наименьшее генетическое расстояние отмечено между популяциями Ls6 и Ls7 (D=0,105), а наибольшее – между популяциями Ls2 и Ls7 (D=0,414).
Заключение
Изученные семь популяций L. sibirica характеризуются высоким уровнем генетического разнообразия на основании полиморфизма ISSR-маркеров. Доля полиморфных локусов в общей выборке составила 97,4%, а ожидаемая гетерозиготность - 0,125. Из семи изученных популяций самые высокие показатели генетического разнообразия отмечены в искусственных насаждениях Ls5 (P95 = 0,830; HE = 0,168; ne = 1,256; R = 10) и Ls4 (P95 = 0,638; HE = 0,157; ne = 1,260; R =1), а самые низкие - в природной популяции Ls2 (P95 = 0,479; HE = 0,074; ne = 1,119; R = 0). Наибольшее число редких аллелей (R =10) отмечено также в популяции Ls5. Полученные результаты согласуются с литературными данными о полиморфизме ISSR-PCR маркеров для других видов хвойных растений. Генетически наиболее близки природные горные популяции Ls6 и Ls7 (D=0,105), расположенные на меньшем географическом расстоянии, наиболее генетически далеки популяции Ls2 и Ls7 (D=0,414). Исследованные популяции L. sibirica значительно дифференцированы, в связи с чем для сохранения генофонда необходимо выбирать популяции из разных частей ареала с учетом происхождения, а также географических и экологических условий произрастания популяций.
На основании результатов исследований даны следующие рекомендации.
1. Для сохранения и возобновления генетических ресурсов L. sibirica на Урале рекомендуется использовать искусственные насаждения лиственницы сибирской Ls5 (P95 =0,830; HE =0,168; ne =1,256; R =10) и Ls4 (P95 =0,638; HE =0,157; ne =1,260; R =1), заложенные еще Ф.А. Теплоуховым; одну популяцию, расположенную в центральной равнинной части Пермского края Ls1 (P95 =0,605; HE =0,121; ne =1,207; R=2); а также популяцию из горно-лесного пояса Урала Ls6 (P95 =0,558; HE =0,135; ne =1,232; R=0).
2. При отборе деревьев для лесовосстановления необходимо учитывать их генотип, а также наличие редких ISSR-PCR маркеров, которые наряду с другими молекулярными маркерами могут быть использованы и для молекулярно-генетической идентификации популяций.
3. Для сохранения генетического разнообразия лиственницы сибирской на популяционном уровне необходимо учитывать генетическую структуру популяций и уровень внутри- и межпопуляционной дифференциации.
Работа выполнена при финансовой поддержке задания 2014/153 на оказание государственных работ в сфере научной деятельности в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки России (№ гос. регистрации 01201461915).
Рецензенты:
Янбаев Ю.А., д.б.н., профессор, проректор по учебной работе ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет», г. Уфа.
Плотникова Е.Г., д.б.н., ведущий научный сотрудник ФГБОУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук» (ИЭГМ УрО РАН), г. Пермь.