Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

В настоящее время вопрос изучения таксономии и биохимических свойств лактобацилл является актуальным. Созданы классификации этих микроорганизмов, основанные на различных признаках, и методики для их идентификации на основе биохимических признаков. Тем не менее, развитие биотехнологии и промышленной микробиологии требует разработки удобной и быстрой методики для индикации и идентификации лактобацилл.

Для идентификации молочнокислых бактерий изучают их морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства штаммов. Перспективно также использование серологического метода, позволяющего с довольно высокой достоверностью определить видовую принадлежность молочнокислых бактерий. Обычно этот метод применяют как дополнительный. Основной же подбор штаммов по производственно-ценным показателям ведется на основании биохимических и физиологических исследований [7, 9].

Для успешного культивирования того или иного микроорганизма питательные среды по своим свойствам должны быть приближены к естественным условиям его обитания. Для культивирования бактерий рода Lactobacillus используются среды, богатые питательными веществами (дрожжевой экстракт, гидролизат обезжиренного молока, пептон, твин-80), различными солями, в том числе ацетатом натрия и др., и имеющие низкий уровень рН (4,5-6,2).

Бактерии рода Lactobacillus относятся к микроорганизмам, имеющим сложные питательные потребности. Для их активного развития требуется наличие веществ, необходимых для построения бактериальной клетки (нуклеиновых кислот, полисахаридов, аминосахаров и т.д.) [7]. Так, для роста большинства молочнокислых палочек необходимы органические формы азота, которые они сами не синтезируют. Многим видам лактобацилл для развития необходимы витамины. Этим объясняется значительное влияние на их рост добавок к питательной среде различных экстрактов (например, дрожжевого, кукурузного), а также других соединений. Результаты исследований свидетельствуют, что для роста болгарской палочки требуется никотиновая кислота (В5), пантотенат (В3) и рибофлавин (В2) [2, 3]. Присутствие в среде микромагния и марганца также существенно влияет на развитие болгарской палочки. Марганец препятствует автолизу клеток и необходим для нормальных процессов жирового обмена. Наличие солей железа в питательной среде оказывает благоприятное действие на рост культур болгарской палочки, причем установлено, что они практически не растут в отсутствии марганца и/или железа [7]. Таким образом, питательная среда должна удовлетворять потребности Lactobacillus (L.) delbrueckii subsp. bulgaricus в источниках энергии, содержать компоненты, необходимые для конструктивного метаболизма [4].

Традиционно молочнокислые микроорганизмы культивируются и поддерживаются в стерильном молоке, однако при создании технологии сухого бактериального концентрата использование стерильного молока, как среды культивирования, неприемлемо с технологической точки зрения. Из многочисленных питательных сред, применяемых при культивировании молочнокислых микроорганизмов пригодны сбалансированные по азотному, углеводному и витаминному составам среды, которые содержат все необходимые питательные и стимулирующие вещества, находящиеся в форме, которая легко усваивается микроорганизмами.

В качестве источника азота большинство молочнокислых микроорганизмов используют его органические формы. При недостатке органического азота лактобактерии для синтеза ряда органических соединений могут использовать минеральные соединения азота. Рост некоторых молочнокислых бактерий в сложных по составу питательных средах стимулируют аммонийные соли. Для нормального роста и развития L. delbrueckii subsp. bulgaricus необходима среда со сложными органическими формами азота, которые являются источниками пептидов, поскольку они стимулируют рост клеток более эффективно, чем свободные аминокислоты. Пептиды поставляют аминокислоты клетке в легкоусвояемой и при этом защищенной от разрушения форме [6].

Из специальных питательных сред наиболее широкое распространение получила среда МРС. Среда богата питательными веществами и ростовыми факторами; содержит дрожжевой и мясной экстракты, глюкозу, пептон, ацетат натрия, цитрат аммония и твин-80 - источник жирных кислот, необходимых для метаболизма лактобактерий. Кислотность среды - 6,2-6,4. Среда МРС может применяться как для работы с пробиотическими лактобациллами, так и для выделения этих микроорганизмов из продуктов питания и природных биотопов [8, 10].

При выделении лактобацилл из внешней среды, молочных продуктов и других источников возникает необходимость дифференциации их друг от друга и других бактерий. Для решения подобных задач созданы селективные среды, основной особенностью которых был низкий уровень рН (<5,4) и высокая концентрация ионов ацетата, который является ингибитором многих микроорганизмов.

Цель исследования

Изучить биохимические и морфологические свойства штаммов бактерий рода Lactobacillus bulgaricus с использованием коммерческих стандартизированных тест-систем фирмы «HiMedia»; подобрать оптимальный качественный и количественный состав селективной питательной среды для культивирования молочнокислых бактерий при исследовании сахаролитических свойств штаммов Lactobacillus bulgaricus.

Материал и методы исследований

Для выращивания культур бактерий рода Lactobacillus использовали модифицированные питательные среды МРС: полужидкую, содержащую 0,15 % агара (МРС-2) и плотную, содержащую 2 % агара (МРС-4). Состав питательной среды МРС, г/л: пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 20,0; глюкоза - 20,0; твин-80 - 1,0; дикалия гидрофосфат - 2,0; натрия ацетат - 5,0; триаммония цитрат - 2,0; магния сульфат - 0,2; марганца сульфат (MnSO4·4H2O) - 0,05; мясная вода - до 1 л; рН - 6,2±0,1 [8].

Определение принадлежности выделенных бактерий к роду Lactobacillus проводили по ГОСТ 10444.11-89 «Продукты пищевые. Методы обнаружения молочнокислых микроорганизмов» по отношению к окраске по Граму, подвижности, наличию каталазы. К бактериям рода Lactobacillus относили микроаэрофильные, грамположительные, палочковидные, неподвижные, неспорообразующие, не обладающие каталазой микроорганизмы [2].

Микроскопирование препаратов культур бактерий проводили, используя микроскоп фирмы «Rathenow».

Определение ферментации углеводов проводили с использованием дисков с углеводами и бульона с бромкрезоловым пурпурным производства «HiMedia Laboratories Pvt. Limited», (Индия). Бульон с бромкрезоловым пурпурным разливали по 5 мл в пробирки с поплавками и стерилизовали автоклавированием при 1,1 атм. в течение 10 мин.

Лиофильно высушенные штаммы разводили в 1 мл стерильного физиологического раствора и 0,1-0,15 мл высевали на жидкую среду МРС-2. Инкубацию проводили двое суток при 37 оС. Затем выполняли разведения от 10-1 до 10-8 в стерильном физиологическом растворе и высевали на чашки с плотной средой МРС-4. Рассев выполняли с каждого разведения. Инкубировали в течение 2-3 суток при 37 оС в анаэробных условиях с использованием анаэростатов и газогенерирующих пакетов GasPack (BD BBL, США). Изолированные колонии, типичные для лактобацилл, пересевали на полужидкую среду МРС-2. Через двое суток инкубации из всех пробирок выполняли контрольные мазки, после чего культуры использовали для постановки пестрого ряда.

В состав пестрого ряда входили 14 субстратов (сахаров и многоатомных спиртов): арабиноза, целлобиоза, галактоза, лактоза, мальтоза, маннит, манноза, мелибиоза, раффиноза, салицин, сахароза, трегалоза, ксилоза, сорбит.

Бульон с бромкрезоловым пурпурным засевали двумя каплями 48-часовой культуры со среды МРС-2 с последующим встряхиванием пробирки для лучшего размешивания.

После посева испытуемого микроорганизма в каждую пробирку асептически помещали по одному диску с соответствующим углеводом. Посевы инкубировали в течение 18-48 часов при 35-37 оС. Результаты учитывали через 18 и 48 часов. При выращивании на бульоне с бромкрезоловым пурпурным образующаяся кислота способствует окрашиванию среды в желтый цвет, а газ скапливается в поплавке [11].

Результаты исследования и их обсуждение

Изучение биохимических свойств лактобацилл, в частности способности ферментировать углеводы, является основой для видовой идентификации этих бактерий. В работе использовали пять штаммов бактерий рода Lactobacillus, предоставленных ФГУП ГосНИИ «Генетика» (Москва): L. delbrueckii subsp. bulgaricus ВКПМ В-3141, L. delbrueckii subsp. bulgaricus ВКПМ В-6543, L. delbrueckii subsp. bulgaricus ВКПМ В-3964, L. delbrueckii subsp. bulgaricus ВКПМ В-6515, L. delbrueckii subsp. bulgaricus ВКПМ В-6516. Необходимо отметить, что первичное установление способности ферментировать сахара, многоатомные спирты и гидролизовать глюкозиды и видовая идентификация этих микроорганизмов была проведена в 1990 году при их выделении с использованием доступных и актуальных на тот момент тест-систем и питательных основ. Нашей задачей является расширенное изучение биохимических свойств этих штаммов с использованием коммерческих стандартизированных тест-систем фирмы «HiMedia».

Для выращивания культур бактерий рода Lactobacillus использовали модифицированные питательные среды МРС: полужидкую, содержащую 0,15 % агара (МРС-2) и плотную, содержащую 2 % агара (МРС-4).

На первом этапе исследования проводили изучение культурально-морфологических признаков исследуемых штаммов L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Выращивание предварительно разведенных в 1 мл стерильного физиологического раствора лиофильно высушенных штаммов, проводили в модифицированных питательных средах МРС: полужидкой, содержащей 0,15 % агара (МРС-2) и плотной, содержащей 2 % агара (МРС-4).

Приготовление клеточных препаратов штаммов молочнокислых термофильных бактерий разного происхождения с последующим их микроскопированием показал, что все выделенные штаммы из различных источников, являются грамположительными палочками, одиночные либо расположенные цепочками (табл. 1).

Таблица 1

Культурально-морфологические признаки штаммов лактобацилл

Следующим этапом работы явилось исследование биохимических признаков штаммов, а именно сахаролитических свойств.

Микроорганизмы вида L. delbrueckii subsp. bulgaricus относятся к группе гомоферментативных лактобацилл. Метаболизм сахаров у штаммов бактерий этой группы происходит по гликолитическому пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса. Гомоферментативные лактобациллы, как правило, неспособны сбраживать пентозы, что подтверждено нашими исследованиями (табл. 2).

Классическая микробиологическая схема идентификации этих видов основана на изучении метаболизма сахаров и представляет собой «пестрый ряд», состоящий из 14 субстратов. В результате работы нами был изучен спектр утилизируемых субстратов: углеводов, в том числе олигосахарид раффиноза, метаболизм которого вновь выделенными штаммами не был изучен ранее, многоатомных спиртов (сорбит, манит) и глюкозидов (салицин, эскулин).

Гомоферментативные лактобациллы вида L. delbrueckii subsp. bulgaricus неспособны сбраживать пентозы, так как ферментация происходит по гликолитическому пути.

Таблица 2

 Способность вновь выделенных штаммов L. delbrueckii subsp. bulgaricus к ферментации сахаров, многоатомных спиртов и гидролизу глюкозидов

Практический и научный интерес представляет изучение способности лактобацилл к утилизации раффинозы. Этот углевод относится к группе фосфоолигосахаридов (ФОС), используется в составе пробиотических препаратов в качестве пребиотического компонента. Способность к утилизации этого олигосахарида зависит от наличия или отсутствия специфических гликозилгидролаз. Утилизации раффинозы у штаммов бактерий вида L. delbrueckii subsp. bulgaricus не наблюдалось. Из таблицы 2 видно, что все исследуемые штаммы лактобактерий хорошо ферментируют лактозу. Один штамм Lactobacillus bulgaricus ферментирует сахарозу, два штамма ферментируют мальтозу, остальные два штамма - маннозу. Таким образом, по своим свойствам изучаемые штаммы неоднородны. Из литературных данных известно, что наиболее важным источником энергии для молочнокислых бактерий являются моно- и дисахариды - глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза. Основным конечным продуктом расщепления глюкозы является D(-) молочная кислота (до 2 %) [4].

Выводы

Анализируя полученные результаты по ферментации штаммов болгарской палочки можно сделать вывод, что подобранный состав питательной среды вызывает изменение сахаролитических свойств данных культур в процессе культивирования, по-видимому, за счет изменения активной кислотности. Однако при культивировании изменение активной кислотности идет быстрее, то есть среда в большей мере обеспечивает развитие исследуемых культур. Следует также отметить, что при достижении определенного значения рН скорость ферментации отдельных штаммов значительно уменьшается, что свидетельствует о торможении развития культур, которое может быть вызвано как недостатком нутриентов в среде, так и ингибированием продуктами метаболизма, в частности избытком молочной кислоты.

Исследованы морфологические и сахаролитические свойства штаммов L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Исследование морфологии выделенных штаммов в фазово-контрастном микроскопе показало, что культура представлена грамположительными палочками, собранными в пары или расположенными поодиночке. При исследовании сахаролитических свойств штаммов болгарской палочки было установлено, что бактерии в полной мере ферментируют лактозу, а некоторые из штаммов способны усваивать сахарозу, мальтозу, маннозу. В заключение можно сказать, что сбраживание углеводов и спиртов является важным диагностическим признаком молочнокислых палочек.

Лавряшина М.Б., д.б.н., доцент, профессор кафедры Генетики, ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный университет», г. Кемерово;

Гореликова Г.А., д.т.н., профессор кафедры Товароведение и управление качеством, ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности», г. Кемерово.