В России в структуре онкологической заболеваемости населения в 2013 году  рак слизистой оболочки полости рта составляет около 5,5 % [3]. Среди опухолей головы и шеи данная патология занимает второе место, после рака гортани [7]. У мужчин данное заболевание встречается в 4 раза чаще, чем у женщин. Максимальное число заболеваний приходится на возрастную группу 40-60 лет, наиболее трудоспособный возраст [7,1].

Рак орофарингеальной зоны среди причин летальности стоит на 4-ом месте  после рака легкого, желудка и колоректальной зоны [7].

В Российской Федерации смертность от рака органов полости рта у мужчин занимает 7 место, в то время как  у женщин - 16-е и составили в 2007 году 8,1 и 1,1 на 100 тысяч населения [7,1].

Развитие регионарных метастазов после комбинированного лечения наблюдается у 40-75 % больных, а отдаленное метастазирование выявляется в 15 % [5].

Лечение регионарных метастазов, в большинстве случаев, осуществляется хирургически, но ряд авторов утверждают, что необходимо проводить  комбинированное лечение, где  первым этапом является лучевая терапия [6]. 

Следует отметить, что после комбинированного и даже  комплексного лечения местные рецидивы у больных раком органов полости рта  возникают в 25-40 %  [4].

Для опухолевого процесса с распространенностью Т3 3-х и 5-летняя выживаемость равна 27 % и 19 %, в то время как Т4 - 21 % и 13 %  [8]. Данные П.Ю. Полякова с соавт. (1997)  свидетельствуют, что при IV стадии 3-х летняя выживаемость не зависит от метода лечения и не превышает 10,9 %.

Пятилетняя выживаемость при  комбинированном методе лечения у больных с I стадии составила 60-85 %, при II стадии - 50-60 % [9]. Наличие III стадии РОПР дает возможность прогнозировать пятилетнюю безрецидивную выживаемость у больных  после комбинированного и комплексного лечения не более чем в 10-12 %. В то время как при IV стадии независимо от методов лечения трехлетняя безрецидивная выживаемость составляет 5,0-10,9 % [6].

Большое значение для прогноза течения рака разных локализаций  уделяется исследованиям таких молекулярных маркеров, как: белок Ki 67 (пролиферация) иp53, CD34 (внутриопухолевая микрососудистая плотность). Следует отметить, что в литературе имеются противоречивые сведения в отношении точности прогнозирования этих факторов, поэтому в регулярной практике их использование не рекомендуется [2,10].

Мы не встречали работ, посвященных исследованию данных маркеров у больных раком органов полости рта, что послужило основанием к исследованию новых способов прогнозирования развития регионарных метастазов и рецидивов у больных раком органов полости рта с использованием Ki 67, p53, CD34.

Цель исследования. Изучение экспрессии некоторых молекулярно-биологических маркеров (р53, ki-67, CD34) при раке органов полости рта без метастазов, в группе с метастазами и рецидивами и оценка возможности их индивидуального или комплексного использования для прогнозирования течения злокачественного процесса.

Материалы и методы. Объектом исследования  были 90 больных РОПР, которые были разделены на 3 группы по 30 человек, первая группа с наличием регионарных метастазов, вторая - без метастазов, третья - с рецидивами, проходивших лечение в отделении опухолей головы и шеи ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ в 2004-2012 гг.

Мужчин было 69, женщин - 21. Возраст больных составлял 36-75 лет. По распространенности процесса: со II  стадией (T2N0M0)  было 19человек, III - 37 (T2N1M0 - 9, T3N0M0 - 21, T3N1M0 - 7), IV - 34 (T3N2M0 - 5, T4N0M0 - 17, T4N1M0 - 12).

У 73 (81,1 %) больных опухолевым процессом был поражен язык, у 17 (18,9 %) - слизистая дна полости рта. На языке опухоль располагалась чаще на боковой поверхности (54,4 %).

У всех больных был плоскоклеточный рак. Высокая степень дифференцировки (G1) имела место у 24 больных, средняя степень (G2) - 43 и низкая степень (G3) - 23.

Иммуногистохимическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Использовались в работе первичные антитела: антиген ki-67, пролиферативная активность (ядерное окрашивание), нормальный и мутантный тип p53 (ядерное окрашивание), CD34 (мембранное окрашивание эндотелиальных клеток).

Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-LinkThermo. Протокол включал в себя предварительный нагрев  до 65 ⁰С, восстановление антигена в течение 20 минут при температуре 97 ⁰С и дальнейшее охлаждение до 65 ⁰С. Затем стекла промывались в течение 1-3 минут TBS-буфером (Dako) и помещались в автостейнер Thermo Scientific для окрашивания в автоматическом режиме. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали систему детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, для заключения использовали бальзам Bio-Mount. Оценку экспрессии маркеров изучали как минимум на 10 случайно выбранных полях с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением х10, х20, х40.

В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров:

1) опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реакция с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25 %, и положительной по р53, если было окрашено более 25 % ядер опухолевых клеток;

2) для оценки пролиферативной активности опухоли подсчитывали количество ki-67-положительных опухолевых клеток, приходящихся на 200-300 опухолевых клеток.

Маркеры пролиферативной активности расценивались на основе наиболее часто употребляющегося способа оценки пролиферативной активности:

0 % - 20 % - низкая пролиферативная активность,

21 % - 50 % - умеренная пролиферативная активность,

51 % - 100 % - высокая пролиферативная активность.

3) Для оценки ангиогенеза в опухолях использовали индекс внутриопухолевой микрососудистой плотности (intratumor microvessel density - MVD), который определяется стандартным иммуногистохимическим методом с использованием эндотелиальных антигенов и позволяет количественно оценить процесс ангиогенеза в опухоли. Микрососуды окрашивали антителом CD34. Количество сосудов определяли в каждом поле зрения препарата при использовании объектива х40.

Статистическая обработка осуществлялась программой Statistica 6,0.

Результаты исследования и их обсуждение

Проведение ИГХ исследования выявило наличие достоверных различий экспрессии опухолевыми клетками Ki-67 и P53 между группами больных раком органов полости рта без метастазов, с метастазами и рецидивами (табл. 1).

Таблица 1

Экспрессия опухолевыми клетками Ki-67 и P53 в исследуемых группах %.

* - отличия показателей, статистически достоверных по отношению к группе без метастазов (р≤0,05).

º - отличия показателей, статистически достоверных по отношению к группе с метастазами (р≤0,05).

Анализ данных показал, что в группе больных раком органов полости рта с метастазами показатели экспрессии маркера р53 превосходило в 2,8 и 1,8 показатель в группах без метастазов и с рецидивами (р≤0,05). В то время как в группе без метастазов, по сравнению с рецидивной группой, показатели в 1,6 раза были меньше (р<0,05).

Проведенное исследование пролиферативной активности опухолей показали преобладание опухолей с низкой пролиферативной активностью в группах без метастазов и с рецидивами, в то время как в группе с метастазами преобладали опухоли умеренной пролиферативной активности. Минимальное количество опухолей с высокой ПА выявлено в группе без метастазов, максимальное - в группе с метастазами. Соотношение доли опухолей с низкой ПА к доле опухолей с высокой ПА в группе без метастазов составило 10, в группе с рецидивами - 5,7, тогда как в группе с метастазами - 1.

Доля пролиферирующих ki-67 положительных клеток в группе без метастазов находилась в пределах от 10 % до 55 % клеток, в группе с метастазами от 20 % до 70 %, в группе с рецидивами от 10 % до 60 %.

Таблица 2

Доля опухолей с различной пролиферативной активностью (ПА) в исследуемых группах

Из табл. 2 следует, что в группе с метастазами отмечается максимальный индекс пролиферативной активности, превышающий аналогичный показатель в  1,9 и 1,7 раза в группе без метастазов и с рецидивами (р≤0,05). Однако статистически значимой разницы пролиферативной активности между группами без метастазов и с рецидивами не получено.

Данные, полученные при оценке внутриопухолевой микрососудистой плотности, показали, что метастазирующие опухоли органов полости рта имели наиболее активные процессы пролиферации опухолевых клеток, в группе больных с рецидивами их активность была несколько ниже и регистрировалась не по всем изученным показателям, в опухолях  больных без метастазов она была минимальной среди всех исследованных групп. Так, процессы неоангиогенеза имели схожую активность в опухолях больных раком органов полости рта с метастазами и рецидивами и превышали показатели в группе больных без метастазов.

Данные, отражающие экспрессию CD34 на эндотелии микрососудов опухолей полости рта в группах без метастазов, с метастазами и с рецидивами, представлены в табл. 3.

Таблица 3

Сравнительная характеристика  внутриопухолевой микрососудистой плотности

Примечание:

* - отличия показателей достоверны по отношению к группе без метастазов (Р≤0,05);

• - отличие достоверно по отношению к группе с метастазами (Р≤0,05).

Проведя оценку внутриопухолевой микрососудистой плотности, выявленной нами при иммуногистохимическом исследовании с использованием антител CD34, мы обнаружили, что в группе без метастазов она составила 6,4±0,7 сосуда в 1 поле зрения. В группах с метастазами и рецидивами наиболее выраженные изменения внутриопухолевой микрососудистой плотности, по сравнению с группой без метастазов, соответствовали превышению в 1,4 и 1,5 раза количества окрашенных антителами  CD34 сосудов, и равнялось  для опухолей данных групп 8,8±0,9 и   9,7±0,8 сосуда в 1 поле зрения.

Несмотря на данные литературы, согласно которым белок Ki 67 и p53 точности прогнозирования не дают [10], по нашему мнению, данные маркеры недооценены и могут быть использованы для прогноза течения заболевания рака органов полости рта, о чем свидетельствуют полученные результаты исследования.

Заключение

1. Проведенное исследование показало наиболее значимые показатели экспрессии опухолевыми клетками р53 в группе с метастазами, превосходящее данный показатель в группах без метастазов и с рецидивами в два и более раз (р≤0,05). Исследование пролиферативной активности опухолей групп больных раком органов полости рта с наличием регионарных метастазов, без них и с рецидивами показало преобладание опухолей с низкой пролиферативной активностью в группах без метастазов и с рецидивами, тогда как в группе с метастазами преобладали опухоли умеренной пролиферативной активности. Таким образом, высокие показатели экспрессии опухолевыми клетками р53, ki-67 могут расцениваться как неблагоприятные прогностические признаки.
2. Проведенные иммуногистохимические исследования с использованием эндотелиального антигена у больных раком органов полости рта показали, что преобладание сосудов крупного диаметра с утолщенной стенкой может быть связано с наличием или возможным развитием метастазов и рецидивов, являясь неблагоприятным предиктором заболевания.

Рецензенты:

Франциянц Е.М., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону;

Каймакчи О.Ю., д.м.н., ассистент кафедры онкологии Ростовского государственного медицинского университета, г. Ростов-на-Дону.