Целью работы явилось изучение острой токсичности и противовоспалительной активности настоя и водорастворимого полисахаридного комплекса, полученных из травы герани сибирской.
Объектом исследования служила измельченная воздушно-сухая трава герани сибирской (Geranium sibiricum L.), заготовленная в Курской и Орловской областях в 2013-2014 гг. в период массового цветения растения.
Методы исследования. Для фармакологических исследований использовали настой и водорастворимый полисахаридный комплекс, полученные из травы герани сибирской.
Эксперименты проводили в соответствии с установленными документами «Об утверждении правил лабораторной практики» [6].
Настой из травы герани сибирской готовили по методике ГФ ХI издания [3]. Для выделения полисахаридного комплекса воздушно-сухое измельченное сырье предварительно обрабатывали спиртом этиловым 70% для удаления полифенольных соединений. Далее из воздушно-сухого шрота выделяли водорастворимый полисахаридный комплекс. Для этого проводили его экстрагирование водой в соотношении 1:20 к массе сырья при нагревании до 95°С в течение 1 ч при постоянном перемешивании. Повторное извлечение полисахаридов проводили дважды водой в соотношении 1:10. Растительный материал отделяли центрифугированием, а объединенные экстракты упаривали до 1/5 первоначального объема. Полисахариды осаждали тройным объемом спирта этилового 96%-ного при комнатной температуре. Выпавший плотный осадок полисахаридов отделяли, промывали спиртом этиловым 70%-ным, ацетоном. Полученные водорастворимые полисахариды лиофильно высушивали [2].
Для внедрения в медицинскую практику нового лекарственного препарата необходимо изучение его токсичности на организм, для определения которой использовали методику Б. М. Штабского [8]. Изучение острой токсичности настоя и водорастворимого полисахаридного комплекса герани сибирской проводили на беспородных белых мышах обоего пола массой 18,0-20,0 г. Настой вводили однократно внутрибрюшинно в дозах от 1 г/кг до 5 г/кг (в пересчете на сухое сырье) в объемах от 0,2 мл до 1 мл. Полисахаридный комплекс вводили в дозах от 100 мг/кг до 300 мг/кг, растворенный в воде очищенной. После введения изучаемых веществ каждую группу животных (не менее 6 животных) помещали в изолированную клетку при стандартном температурном и пищевом режиме и вели наблюдение в течение 24 ч [7].
Оценку противовоспалительного действия изучаемого водного извлечения и водорастворимого полисахаридного комплекса проводили в соответствии с методическими рекомендациями по исследованию противовоспалительных препаратов, влияющих на разные стадии процесса воспаления [7].
Антипролиферативные свойства исследуемых фитокомплексов изучали на модели «ватной гранулемы» у беспородных белых крыс массой 180-220 г. [7].
У крыс, находящихся под легким эфирным наркозом, в области спины тщательно выстригали шерсть и в асептических условиях делали разрез кожи и подкожной клетчатки длиной 1-2 см. Затем пинцетом через образовавшийся разрез кожи в подкожной клетчатке формировали полость, куда помещали предварительно простерилизованный ватный шарик массой 25 мг, после чего накладывали 1-2 шва. Через 7 дней, на протяжении которых вводили исследуемый настой в соотношении 1:10 в дозе 1 г/кг массы тела в пересчете на сухое сырье (1 мл) и сумму полисахаридов в дозе 100 мг/кг массы животного, имплантированный шарик с образовавшейся вокруг него грануляционной тканью извлекали и высушивали до постоянной массы при t = 55-60°С. Массу образовавшейся грануляционно-фиброзной ткани определяли по разнице между массами высушенной гранулы и имплантированного ватного шарика. Препарат сравнения (индометацин) и воду очищенную (контроль) вводили в аналогичных условиях.
Антифлогистическую активность исследуемого настоя в дозе 1 г/кг (в пересчете на сухое сырье) и полисахаридного комплекса в дозе 100 мг/кг определяли при моделировании локальной воспалительной реакции с помощью ксилола на кроликах-альбиносах массой 3,0-3,5 кг [5].
У кроликов предварительно выстригали шерсть на коже живота. Настой и полисахаридный комплекс вводили внутримышечно за 1 ч до введения индикатора проницаемости, роль которого выполнял раствор трипановой сини. Трипановую синь вводили в краевую вену уха в виде 1%-ного раствора на растворе натрия хлорида 0,9%-ном из расчета 2 мл на 1 кг массы животного. Длительная циркуляция краски в кровеносном русле позволяет изучить нарушение проницаемости капилляров в течение нескольких часов после ее введения. Показателями проницаемости капилляров служили время появления на коже сине-окрашенных пятен и их диаметр. По разнице во времени появления пятен и их диаметру до и после введения настоя и полисахаридного комплекса судили о его действии на проницаемость капилляров.
Результаты и их обсуждение. Исследование острой токсичности настоя и водорастворимого полисахаридного комплекса травы герани сибирской показало, что в процессе эксперимента внутрибрюшинное введение мышам исследуемого настоя в дозе от 1000 до 5000 мг/кг и водорастворимого полисахаридного комплекса в дозе от 100 до 300 мг/кг не приводило к гибели животных, что позволяет считать данные фитокомплексы не токсичными в испытанном диапазоне доз (таблица 1). LD50 в опытах не установлена, поскольку при введении максимально допустимой по объему вводимого извлечения дозы гибели животных не наблюдали.
Таблица 1
Результаты изучения острой токсичности настоя и водорастворимого полисахаридного комплекса из травы герани сибирской
|
Фитокомплекс |
Доза, мг/кг |
Количество животных |
|
|
живых |
погибших |
||
|
Настой |
1000 |
6 |
0 |
|
2000 |
6 |
0 |
|
|
3000 |
6 |
0 |
|
|
4000 |
6 |
0 |
|
|
5000 |
6 |
0 |
|
|
Водорастворимый полисахаридный комплекс |
100 |
6 |
0 |
|
200 |
6 |
0 |
|
|
300 |
6 |
0 |
|
Исходя из имеющихся данных можно сделать вывод, что исследуемые фитокомплексы по классификации К.К. Сидорова относятся к классу практически нетоксичных.
Изучение антипролиферативной активности показало, что в контрольной группе животных вес грануляционной ткани составил 140,55+8,07 мг. Эта величина нами принята за 100,00%. Под влиянием исследуемых фитокомплексов величина грануляционно-фиброзной ткани по сравнению с контрольными данными была меньше: 56,28% (настой) и 59,78% (водорастворимый полисахаридный комплекс), что приводило к достоверному снижению воспалительного процесса. При этом более выраженная антипролиферативная активность установлена при введении водорастворимого полисахаридного комплекса травы герани сибирской. На фоне приема индометацина вес гранулемы составил 44,27+3,34 мг, антипролиферативный эффект - 68,50% (таблица 2).
Таблица 2
Влияние изучаемых фитокомплексов, полученных из травы герани сибирской на образование грануляционно-фиброзной ткани у крыс
|
Препарат/ фитокомплекс |
Доза |
Число животных |
Масса сухих гранулем (М+m), мг |
Угнетение образования гранулемы, % |
|
Контроль |
|
6 |
140,55+8,07 |
- |
|
Индометацин |
6 мг/кг |
6 |
44,27+3,34* |
68,50 |
|
Настой |
1000 мг/кг |
6 |
61,45+3,18* |
56,28 |
|
Водорастворимый полисахаридный комплекс |
100 мг/кг |
6 |
56,53+2,49* |
59,78 |
Примечание * - различия по сравнению с контролем статистически достоверны при Р < 0,05.
В результате проведенных действий установлено, что исследуемые фитокомплексы оказывали менее выраженное влияние на пролиферативную фазу воспаления, чем препарат сравнения (индометацин), но достоверное по сравнению с контролем.
При исследовании антифлогистической активности установлено, что в случаях введения изучаемых фитокомплексов пятна окрашивания, свидетельствующие о проникновении трипановой сини через гистогематический барьер, появлялись позже по сравнению с контролем, т. Е. увеличивался латентный период появления пятен окрашивания от 4,07+0,18 мин до 8,22 +0,57 мин, а также уменьшался их диаметр от 1,38+0,04 см до 1,09+0,04 см. При введении настоя наблюдалось уменьшение сосудистой проницаемости для трипановой сини, но статистически недостоверное по сравнению с контролем. Водорастворимый полисахаридный комплекс, выделенный из травы герани сибирской, проявил более выраженную антифлогистическую активность (таблица 3).
Таким образом, установлено, что капилляроукрепляющим действием обладает только водорастворимый полисахаридный комплекс.
Таблица 3
Влияние изучаемых фитокомплексов, полученных из травы герани сибирской, на проницаемость капилляров у кроликов
|
Фитокомплекс |
Доза
|
Латентный период появления пятен окрашивания, мин |
Увеличение латентного периода появления пятен окрашивания, |
Диаметр пятен окрашивания, см |
Уменьшение диаметра пятен окрашивания, % |
|
|
мин |
% |
|||||
|
Контроль |
|
3,96+0,18 |
|
|
1,74+0,03 |
|
|
Настой |
1000 мг/кг |
4,07+0,18 |
0,11 |
2,77 |
1,38+0,04 |
20,69 |
|
Водораствори мый полисахаридный комплекс |
100 мг/кг |
8,22+0,57* |
4,26 |
107,57 |
1,09+0,04* |
37,35 |
Примечание * - различия по сравнению с контролем статистически достоверны при Р < 0,05. Число животных в контроле в каждом варианте опыта 10.
Выводы
1. В ходе фармакологических исследований было установлено, что настой и водорастворимый полисахаридный комплекс травы герани сибирской относятся к классу практически нетоксичных.
2. Доказано наличие антипролиферативной и антифлогистической активности у водорастворимого полисахаридного комплекса и антипролиферативной активности у настоя исследуемого растения.
Рецензенты:
Раздорская И.М., д. фарм.н., профессор, заведующая кафедрой управления и экономики фармации ГБОУ ВПО «КГМУ», г. Курск.
Сипливая Л.Е., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой фармацевтической, токсикологической и аналитической химии ГБОУ ВПО «КГМУ», г. Курск.