Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Юг Дальнего Востока России является эндемичным регионом по геморрагической лихорадке с почечным синдромом (ГЛПС), которая широко распространена в Евразии и представляет собой серьезную проблему в связи с тяжестью клинического течения, отсутствием эффективных средств этиотропной терапии и специфической профилактики. По данным молекулярно-биологических исследований [6, 7] этиологическими агентами ГЛПС в очагах сельского эпидемиологического типа в регионе выступают хантавирусыAmur и Hantaan (геновариантFE), в очаге городского эпидемиологического типа - хантавирусSeoul (геновариантVDV). Геном хантавирусов представлен отрицательной одноцепочечной РНК, состоит из большого (L), среднего (M) и малого (S) сегментов, которые кодируют вирусную РНК-полимеразу, гликопротеины  Gn и Gc (ранее G1 и G2) и нуклеокапсидный белок N соответственно [9].

ГЛПС относится к числу трудно диагностируемых заболеваний из-за комплекса клинико-патогенетических синдромов, что влечет несвоевременную госпитализацию, когда исход болезни определяет не вирусемия, требующая этиотропной терапии, а полиорганная недостаточность и развитие неотложных состояний. В настоящее время в России основным методом для подтверждения диагноза ГЛПС при проведении клинико-лабораторных исследований  является непрямой метод флюоресцирующих антител (НМФА), который в большинстве случаев позволяет выявлять антитела к хантавирусамс 7 дня от начала заболевания. Исключение составляют больные с поздней выработкой антител, концентрации которыхне достаточно для выявления в НМФА, а такжесеронегативные случаи, число которых, по оценкам некоторых авторов, колеблется от 1,2% до 5,0%.Вирусологические методы исследования не используютсядля раннейпостановкидиагноза ГЛПС, поскольку хантавирусыотносительно медленно размножаются в культуре клеток.

Применение молекулярно-биологических методов исследования - одно из новых направлений в изучении хантавирусов и вызываемых ими инфекций [2]. Реакция обратной транскрипции с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) - высокочувствительный метод, в котором в качестве исходной матрицы используется кДНК, полученная методом обратной транскрипции отрицательно заряженной РНКхантавируса. Высокая чувствительность определяет значимую роль ОТ-ПЦРв ранней диагностике хантавирусных инфекций.

ПЦР широко используется при изучении патогенеза многих вирусных инфекций и эффективности использования противовирусных средств. В настоящее время этиотропная терапия вирусных заболеваний приобретает все большую значимость. В терапии острых и хронических рецидивирующих инфекций используется обладающий широким спектром активности против РНК- и ДНК-содержащих вирусов препарат рибавирин. Однако клиническая эффективность рибавирина была подтверждена только при назначении его в начальном периоде болезни. В России этиотропная терапии у больных ГЛПС не получила распространения, что можно объяснить мнением о коротком периоде виремии при ГЛПС, а также поздним сроком госпитализации большой части пациентов с тяжелыми формами инфекции, когда уже не наблюдается быстрого прерывания репликации хантавирусов  противовирусными средствами.   

Цель работы - провести анализ эффективности применения метода ОТ-ПЦР при ранней диагностике хантавирусных инфекций, обусловленных вирусамиHantaan, Amur и Seoul,по данным выявления РНК хантавируса у больных ГЛПС в сыворотках крови, циркулирующих иммунных комплексах и макрофагах бронхоальвеолярного лаважа, а также при оценке эффективности этиотропной терапии.

Материалы и методы

Клиническим материалом для исследования служили пробы крови (n=97) от больных ГЛПС, заразившихся в очагах сельского и городского эпидемиологического типов на территории Приморского края и находившихся на лечении в инфекционных отделениях больниц г. Владивостока. Пробы крови хранились до лабораторного исследования при температуре- 250С. Специфические антитела в сыворотках крови больных ГЛПС выявляли в НМФА по общепринятой методике. Концентрацию циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводили с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000. При этом 10% раствор ПЭГ, приготовленный на 0,1 М боратном буферном растворе рН 8,4, доводили до конечной концентрации 4%. Бронхоальвеолярный лаваж был проведен у шести пациентов, находившихся на стационарном лечении в инфекционном отделении, на 7-10 день от начала заболевания. Полученный бронхоальвеолярный смыв (БАС) хранили в замороженном состоянии.

Оценку эффективности применения препаратов рибавирина (виразол - инфузионная форма и верорибавирин - пероральная форма), которые были включены в комплекс традиционной патогенетической терапии, проводили у 20 больных с тяжелым течением ГЛПС, ассоциированной с вирусами Hantaan,Amurи Seoul. В качестве контроля были взяты сопоставимые по возрасту, полу и тяжести пациенты (n = 20) без включения противовирусных средств в традиционную терапию.  Начало лечения у всех больных приходилось на 4-5 день от начала заболевания.В течение болезни обозначены следующие периоды: лихорадочный (1-7 день), олигурический (8-14 день), полиурический (15-21день) и реконвалесценции (с 22 дня от начала болезни) [3].

Выделение общей РНК проводили стандартным методом комплектами реагентов «ВектоРНК-экстракция» (ЗАО «Вектор-Бест»), «РИБО-сорб» и «РИБО-золь-С» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Синтез кДНК и амплификацию фрагментов кДНК проводили методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров и условий тест-системы «Векто-Ханта-РНК-ампли» (участок S-сегмента, группоспецифичного к хантавирусамHantaan, Amur и Seoul) и набором реагентов «АмплиСенсRHantavirus» (Hantavirusкомплекса ГЛПС), согласно инструкции производителей. Визуальную индикацию полученных ПЦР-продуктов осуществляли методом гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле в присутствии бромида этидия.

Результаты и обсуждение

Нами проанализировано несколько значимых в диагностике и лечении ГЛПС аспектов приложения ОТ-ПЦР (табл. 1).

Таблица 1

Изучаемые аспекты приложения ОТ-ПЦР при ГЛПС

Ранняя постановка лабораторного диагноза при ГЛПС, вызываемой разными серотипами хантавирусов, имеет большое значение при выборе правильной тактики ведения и лечения больных. Сыворотки крови от больных ГЛПС с разной тяжестью течения болезни (n = 51) были исследованы с помощью ОТ-ПЦР в динамике заболевания. Частота выявления РНК хантавируса в крови больных изменялась по ходу болезни и достоверно снижалась к периоду ранней реконвалесценции. Так, частота обнаружения РНК хантавируса в крови больных с тяжелым и среднетяжелым течением инфекции в олигурический период была примерно одинаковой (около 63%), снижаясьв полиурический период до 13%.Специфическую РНК обнаруживали до 18-20 дня от начала заболевания.

Метод ОТ-ПЦР был применен нами для установления специфической природы ЦИК у больных ГЛПС. Специфические ЦИК выявлялись при разном течении инфекции. Отмечено, что при тяжелой форме болезни частота выявления РНК хантавируса в составе ЦИК была выше, чем у больных со среднетяжелой формой заболевания. Следующим явилось изучение динамики выявления РНК хантавируса в составе ЦИК. Специфические антитела в сыворотках крови больных ГЛПС регистрировались с 5-6 дня заболевания, достигали максимальных значений к третьей неделе с дальнейшим выходом на плато. В этой же обследуемой группе больных уровень ЦИК соответствовал уровню антителообразования в каждом периоде болезни, при этом параллельно изменялась динамика частоты присутствия специфической РНК в составе ЦИК. До 10 дня заболевания РНК хантавируса в составе иммунных комплексов (n=28) была обнаружена в 6 образцах сывороток (21,4%), а  с 11 по 21 день - в 16 образцах (57,1%). В сыворотках крови поздних реконвалесцентов ГЛПС (n = 22), взятых в период от 1,5 месяцев до 2-х лет от начала заболевания и не имевших отклонения биохимических показателей от нормы, в шести случаях были выявлены неспецифические ЦИК, в составе которых не обнаружена геномная РНК хантавируса.

При исследовании в ОТ-ПЦР образцов бронхоальвеолярных смывов РНК хантавируса была обнаружена у трех из пяти пациентов со среднетяжелым течением инфекции в олигоурический период (с 8 по 11 день от начала заболевания). У одного больного вирусная РНК в макрофагах БАС была обнаружена на 20 день болезни, когда положительные находки в сыворотках крови очень редки.

Эффективность лечения противовирусными средствами оценивалась при сравнении динамики элиминации РНК хантавируса из крови двух групп больных ГЛПС с тяжелой формой заболевания - контрольная (получали комплексную традиционную патогенетическую терапию) и опытная (с дополнительным включением препаратов рибавирина). Кровь у пациентов обеих групп забиралась с 3-4 дня по 23-24 день от начала заболевания.  Перед началом этиотропной терапии РНК хантавируса была выявлена у пациентов обеих групп (табл. 2).

Таблица 2

Оценка эффективности противовирусной терапии в лечении больных

с тяжелой формой  ГЛПС по данным обнаружения РНК хантавируса в ОТ-ПЦР

Продолжительность обнаружения РНК хантавируса и количество положительных РНК-проб в ходе лечения виразолом и рибавирином были меньше, чем без применения противовирусных средств. Так, РНК хантавируса через 1-2 дня после введения виразола обнаруживалась у 60% и 85% больных из опытной и контрольной групп соответственно (табл. 2). В среднем специфическая РНК у пациентов из опытной группы не обнаруживалась в крови уже через 3-4 дня после введения виразола, в то время как в контрольной группе положительные РНК-пробы выявлялись до 12-14 дня заболевания. Кроме того, более выраженнаявирусемия в контрольной группе коррелировала с более высоким содержанием в крови специфических ЦИК, имеющих патогенетическое значение при ГЛПС.

В работе Морозова В.Г с соавт. [4] при использовании в ПЦР-амплификации стандартного «гнездового» набора праймеров к М-сегменту РНК хантавирусабыла выявлена у 42,7% обследованных больных ГЛПС, с присутствием в крови до 15 дня болезни. В наших исследованиях с помощьюамплификационной тест-системы «Вектор-Бест» с двумя парамипраймеров к S-сегменту, кодирующему белок N и отличающемуся высокой консервативностью среди хантавирусов,в олигурический период РНК хантавирусабыла выявленау 63% больных ГЛПС, сприсутствиемв 13%случаях до конца полиурического периода. На примере вируса Hantaanкитайскими исследователями [8] при детекции вирусной РНК в крови больных ГЛПС была показана большая эффективность праймеров к S-гену, по сравнению с  праймерами к М-гену.

Б.З. Сиротин [5] представил доказательства, отрицающие роль иммунокомплексных механизмов в формировании органной патологии при ГЛПС, считая при этом ЦИК как нейтрализующие, способствующие элиминации возбудителя из организма больного. Наши данные согласуются с этим мнением: в составе ЦИК мы выявляли РНК хантавируса в начальный период болезни в 2,7 раза реже, чем к концу третьей недели заболевания, что может  свидетельствовать о том, что индукция ЦИК при ГЛПС носит скорее защитный, чем повреждающий характер. Ранее специфическая природа ЦИК у больных ГЛПС была подтверждена с помощью прямого иммуноферментного анализа в условиях избытка антигена [1]. Мы применили более чувствительный ПЦР-анализ, позволяющий исследовать широкий спектр иммунных комплексов, независимо от их физико-химических свойств.

Детекция РНК хантавируса в макрофагах бронхоальвеолярных смывов у больных ГЛПС продемонстрировала возможность применения ОТ-ПЦР в качестве дополнительного метода при диагностике ранних и серонегативных форм заболевания, когда использование серологических тестов не эффективно. Кроме того, наличие специфической РНК в макрофагах БАС подтверждает респираторный путь инфицирования человека хантавирусом и безусловное участие клеток респираторного тракта в раннем иммунном ответе при ГЛПС.

Назначениерибавирина у больных ГЛПС, обусловленной хантавирусамиPuumala (в России), Hantaan (в Китае) и SinNombre (в США), по данным отечественных и зарубежных исследователей, оказалось эффективным в ранние сроки заболевания, вызывая быстрое снижение вирусной нагрузки и прекращение репликации вируса. Наши исследования подтверждают эти данные и свидетельствуют об эффективности применения виразола при тяжелом течении Hantaan-, Amur- и Seoul-вирусной инфекций по вирусологическому показателю (быстрое снижениевиремии в крови пациентов опытной группы). Применение молекулярно-генетических методов исследования позволило установить продолжительное присутствие РНК хантавируса в крови больных от начала болезни, что диктует необходимость применения противовирусных препаратов в разгар заболевания и контроля их эффективности при лечении ГЛПС, вызванной разными серотипами хантавирусов.

Заключение

Получены новые данные о возможности использования ОТ-ПЦР при исследовании макрофагов бронхоальвеолярного лаважа для уточнения диагноза ГЛПС в сомнительных случаях, раннего выявления вирусемии в сыворотках крови, специфичности циркулирующих иммунных комплексов, а также оценки элиминации вирусной РНК при применении противовирусных средств у больных с Hantaan-, Amur- и Seoul-вирусной инфекциями. Таким образом, метод ОТ-ПЦР перспективен в плане ранней диагностики и оценки эффективности этиотропной терапии у больных ГЛПС, обусловленной разными серотипами хантавирусов.

Коршукова О.А.,д.м.н., профессор, руководитель научного отдела ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г.Владивосток;

Зайцева Е.А.,д.м.н., профессор кафедры микробиологии и вирусологии, ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г.Владивосток.