Биокатализаторы использовались человеком на протяжении многих веков, и на сегодняшний день количество ферментов, применяемых в различных сферах жизни, постоянно растет. В настоящее время актуальным является поиск наиболее перспективных способов получения ферментов, так как производство препаратов на их основе занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии, а объемы продукции постоянно увеличиваются [3]. Столь широкое применение ферментов связано с их биологической ролью – способностью во много раз увеличивать скорость химических реакций, а также чрезвычайно высокой специфичностью по отношению к определенным веществам и типам реакций.
Достаточно широко и успешно применяются амилазы, которые делятся на альфа-, бета- и гамма-амилазу, что связано с их распространением в природе, а также с особой специфичностью по отношению к субстрату.
Существенна роль амилаз в живом организме. Данные ферменты относятся к классу гликозил-гидролаз и катализируют гидролиз крахмала, гликогена и родственных полисахаридов и олигосахаридов с образованием моносахаридов, играя, по нашему мнению, существенную роль в обеспечении механизма пребиотического действия. Амилазная активность микроорганизмов — симбионтов организма человека может иметь клиническое значение в таких процессах, как, например, гидролиз крахмала кишечной микрофлорой или ингибирование образования биопленок у патогенных бактерий [1].
Механизм действия амилаз обусловливает их применение в областях производства, использующих крахмалосодержащее сырье. К ним относится медицинская, текстильная, мясомолочная, спиртовая промышленность, тонкие химические технологии, пивоварение, хлебопечение, производство детергентов, кормовых добавок в сельском хозяйстве, переработка отходов мясной и птицеперерабатывающей промышленности [6].
В период, предшествующий интенсивному развитию ферментной промышленности, главнейшим источником амилазы в странах Европы был солод. Из животного сырья получали амилазы, применяющиеся в медицинских целях [3]. Общепринято, что одним из главных источников амилаз являются микроорганизмы. Для получения промышленных препаратов амилазы используют грибы – Aspergillus oryzae, Aspergillus niger и Aspergillus wentii. Среди бактерий к активным продуцентам амилаз относятся некоторые бациллы (Bacillus macerans, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis), псевдомонады и различные виды стрептомицетов. Амилаза, выделяемая из культуры Bacillus stearothermophilus, не утрачивает своей активности даже при кратковременном нагревании до 1000С. Амилолитические ферменты синтезируют также некоторые дрожжи и дрожжеподобные грибы родов Saccharomyces, Candida, Endomycopsis и Endomyces [2].
На сегодняшний день не утрачивает актуальности изыскание новых микроорганизмов — продуцентов амилазы. По нашему мнению, в качестве приоритетных в этом плане могут выступать природные микробные симбионты, обладающие высокой ферментативной активностью. Одним из таких объектов является природный симбионт Medusomyces gisevii (чайный гриб), который представляет собой сложную микробную ассоциацию в виде массы (зооглеи) на поверхности жидкости и пылевидного осадка на дне сосуда [4]. Достоверно известно, что в состав симбиоза входит несколько видов уксуснокислых бактерий и дрожжей, однако многие авторы при описании этого организма отмечают неидентичность микробиологического состава образцов, отобранных из различных регионов культивирования. Этот факт в совокупности с неидентичностью воспроизведения условий выращивания может приводить к различному компонентному составу метаболитов чайного гриба. В литературных источниках имеются упоминания о содержании в культуральной жидкости чайного гриба фермента амилазы, но данные эти единичны и не содержат сведений о количестве этого фермента на разных этапах культивирования.
Цель работы
В связи с вышеизложенным целью исследования явилось изучение динамики проявления амилолитической активности культуральной жидкости чайного гриба при выращивании его в условиях проблемной научно-исследовательской лаборатории «Экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии» ЦКП Северо-Кавказского Федерального университета.
Материалы и методы исследования
В качестве исследуемого объекта выступала культуральная жидкость Medusomyces gisevii (чайный гриб), отобранная на разных этапах культивирования (10-е, 20-е и 30-е сутки), которое осуществляли в течение месяца при комнатной температуре по классической методике на питательной среде, состоящей из кипяченой водопроводной воды, сахарозы (10%), экстракта черного чая (0,1%).
Маркером интенсивности метаболизма бактериальных клеток, входящих в симбионт, послужило количество общей амилазы в нативной культуральной жидкости, содержащей, кроме жидкой части, фрагменты волокон гриба и микроорганизмы. Однако на практике в биотехнологических и медицинских целях не исключено использование свободного от различных примесей культурального фильтрата исследуемой субстанции. Кроме того, соотношение количества амилазы (общей) в нефильтрованной культуральной жидкости к данному показателю в фильтрате, по нашему мнению, в той или иной мере отражает интенсивность экзогенной метаболической активности микроорганизмов-продуцентов, что характеризует их биотехнологический потенциал.
В связи с вышеизложенным каждая проба культуральной жидкости подразделялась на 2 части. Одна часть подвергалась ультрамикрофильтрации через фильтр 0,22 мкм с целью освобождения исследуемого субстрата от присутствия в нем крупных примесей, нитей и микроорганизмов. Вторая часть пробы фильтрации не подвергалась. Все исследования проводились в десятикратном повторе.
Для определения амилолитической активности использовали метод Каравея [5] в нашей модификации. Принцип метода основан на колориметрическом определении концентрации амилодекстрина по степени интенсивности реакции с йодом и длине волны 650 нм до и после ферментативного гидролиза крахмала амилазой, содержащейся в культуральной среде. При этом нами были определены экспериментальным путем соотношения субстрата и ферментной составляющей. За единицу активности фермента принимали его количество, содержащееся в 1 мл исследуемого биологического раствора, которое расщепляет амилодекстрин (в мкг) за 1 мин при 37°С.
Удельную амилолитическую активность в пробах вычисляли по формуле:
Х= 
,
где Х – удельная амилолитическая активность ферментного препарата культуральной жидкости чайного гриба (мкг/мин×мл); Дк – оптическая плотность контрольного раствора (нм); Дп – оптическая плотность опытного образца (нм); t – время инкубации фермент-субстратной смеси (мин); V – объем пробы (мл).
Результаты исследований
Результаты исследования, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что культуральная жидкость чайного гриба проявляет амилолитическую активность, которая закономерно возрастает с 10-х по 30-е сутки культивирования до 167,8±3,1мкг/мин×мл.
Таблица 1
Средние показатели амилолитической активности культуральной жидкости чайного гриба на разные сутки культивирования, (М±m)*
|
Сроки культивирования, n=10 |
Амилолитическая активность культуральной жидкости, мкг/мин×мл |
|
|
нефильтрованная |
фильтрованная |
|
|
10 суток |
114,3±4,5 |
67,3± 4,2 |
|
20 суток |
141,5±3,2 |
73.7±2,2 |
|
30 суток |
167,8±3,1 |
80,1±4,2 |
*достоверность по тексту.
При этом амилаза, содержащаяся в фильтрате, составляла 58,88 %, 52,08% и 47,73% соответственно на 10-е, 20-е, 30-е сутки культивирования от количества общей амилазы, находящейся в нефильтрованной культуральной среде (при Р ≤0,05).
Заключение
Амилолитическая активность культуральной жидкости сохраняется на протяжении всего периода исследования (30 суток). При этом часть фермента адсорбируется на плотных составных компонентах субстанции, однако практически 50% амилазы сохраняется и в фильтрате. Указанные результаты позволяют рассматривать обе исследуемые субстанции как перспективное биотехнологическое сырье — источник амилазы.
Интенсивность метаболизма микроорганизмов, критерием которой является соотношение общей и экзогенной амилазы, наиболее выражена на ранних сроках культивации.
Исследование проведено при финансовой поддержке Минобрнауки России, в рамках выполнения базовой части государственного задания (2014/2016).
Рецензенты:
Федько Н.А., д.м.н., профессор, декан факультета гуманитарного и медико-биологического образования ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет», 355000, Россия, г. Ставрополь;
Джандарова Т.И., д.б.н., доцент, профессор кафедры анатомии и физиологии ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский Федеральный университет», г. Ставрополь.