Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Ранее нами продемонстрировано изменение иммунного статуса при хронической почечной недостаточности (ХПН) в клинических и в экспериментальных условиях, выражающееся в активации эффекторов врожденного иммунитета и подавлении адаптивного иммунитета [2, 5]. Регуляторы гомеостаза эндогенного происхождения (гормоны, реактанты острой фазы и др.) могут выступать в роли факторов патогенеза и рассматриваться как перспективные агенты коррекции нарушений гомеостаза [1, 3, 4, 6]. При ХПН одним из факторов патогенеза изменений иммунного статуса может выступать паратиреоидный гормон (ПТГ), в избытке циркулирующий в крови в условиях вторичного гиперпаратиреоза (ГПТ). ГПТ и сопутствующие ему изменения фосфорно-кальциевого гомеостаза приводят к накоплению ионизированного кальция в цитоплазме иммунокомпетентных клеток, поэтому обоснованным способом коррекции их функционального статуса и количественного представительства может быть применение блокаторов кальциевых каналов.  Цель работы - исследовать иммунный статус при экспериментальном гиперпаратиреозе и влияние на него блокатора кальциевых каналов амлодипина.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 90 белых нелинейных половозрелых крысах-самцах массой 200-220 г, находящихся в стандартных условиях вивария, случайным образом разделенных на 3 группы: I - интактная, II - ГПТ, III - ГПТ и введение блокатора кальциевых каналов амлодипина. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись при строгом соблюдении требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента с последующей утилизацией. В постановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. ГПТ у крыс II группы моделировали содержанием на гиперфосфатной диете по методу Draper H.H. etal. [7] в нашей модификации. В течение 120 дней рацион крыс состоял из синтетической гиперфосфатной смеси (0,6% кальция и 4,2% фосфора). Развитие ГПТ верифицировали по увеличению концентрации ПТГ в плазме. Животным III группы начиная с 120-х суток эксперимента ежедневно вводили блокатор кальциевых каналов в составе препарата «Амлодипин-Тева» (международное непатентованное название: амлодипин, Израиль) в дозе 0,25 мг/кг в сутки в течение 7 дней, суммарная доза 1,75 мг/кг. Кровь для исследований забирали пункцией левого желудочка сердца. Количество лейкоцитов в крови определяли общепринятым меланжерным методом в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу подсчитывали в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе, количество клеток выражали в относительных (%) и абсолютных (•109/л) величинах. Исследование поглотительной способности нейтрофилов периферической крови проводили на модели поглощения частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистирольного латекса. С помощью иммерсионной микроскопии учитывали активность фагоцитоза - (%) клеток, захвативших хотя бы одну частицу латекса, интенсивность фагоцитоза - (у.е.) число поглощенных микросфер латекса в 100 подсчитанных клетках и фагоцитарное число - (у.е.) число поглощенных микросфер латекса на один нейтрофил. Генерацию активных форм кислорода нейтрофилами оценивали в тесте восстановлении нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму диформазан (НСТ-тесте). Проводили спонтанный и индуцированный НСТ-тест, с помощью иммерсионной микроскопии определяли активность - процент клеток, восстанавливающих НСТ, и интенсивность НСТ-теста, дифференцируя клетки в зависимости от заполнения площади цитоплазмы. Функциональный резерв нейтрофилов определяли как отношение показателей индуцированного НСТ-теста к спонтанному. Оценку гуморального иммунного ответа проводили по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, в абсолютных величинах и в пересчете на ядросодержащие клетки (ЯСК). Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, оценивали по выраженности воспалительного отека стопы. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows v.10.0. Проверку статистических гипотез проводили с использованием критериев Краскела-Уоллиса, Манна-Уитни, Вальда-Вольфовитца, наличие связи между показателями исследовали с помощью коэффициента корреляции Спирмена.

Результаты исследования и их обсуждение. Установлено, что при экспериментальном ГПТ в периферической крови изменяется количественный состав лейкоцитов, в относительных величинах увеличивается количество нейтрофилов за счет палочкоядерных и сегментоядерных форм, увеличивается количество моноцитов, снижается количество лимфоцитов (табл. 1). Пересчет показателей на абсолютные величины выявил моноцитопению и лимфоцитопению, количество лимфоцитов снижается в среднем на 53% по сравнению с группой контроля (табл. 2). При оценке функциональной активности нейтрофилов - ключевых эффекторов врожденного иммунитета - отмечено увеличение интенсивности спонтанного и индуцированного НСТ-теста соответственно на 50% и 26% от средних величин в контрольной группе. Показатели поглотительной способности фагоцитов - активность, интенсивность фагоцитоза и фагоцитарное число - значимо не изменяются. Исследование адаптивного иммунитета при ГПТ выявило угнетение Th1-зависимого иммунного ответа, оцениваемого по интенсивности реакции ГЗТ, а также Th2-зависимого иммунного ответа при подсчете АОК в селезенке в абсолютных величинах и в пересчете на ЯСК. Полагаем, что депрессия показателей адаптивного иммунитета в определенной мере обусловлена лимфоцитопенией. При проведении корреляционного анализа нами установлена прямая средней силы статистически значимая связь между количеством лимфоцитов в периферической крови и абсолютным количеством АОК в селезенке (коэффициент корреляции Спирмена R= 0,69; p<0,05) и интенсивностью реакции ГЗТ (коэффициент корреляции Спирмена R= 0,73; p<0,05).

Таблица 1

Влияние амлодипина на количественный состав лейкоцитов в периферической крови при экспериментальном гиперпаратиреозе в относительных величинах (M±m)

Примечание. Здесь и далее * - статистически значимые (р<0,05) различия с группой 1, ** - с группой 2.

Таблица 2

Влияние амлодипина на количественный состав лейкоцитов в периферической крови при экспериментальном гиперпаратиреозе в абсолютных величинах (M±m)

Эффект ПТГ на иммунокомпетентные клетки и формирование иммунного статуса при гиперпаратиреозе могут быть связаны с прямым и опосредованным действием. Установлено, что 2-й тип рецептора к ПТГ (PTH2R) экспрессируется на гранулоцитах и в меньшей степени - на моноцитах и лимфоцитах [9]. В литературе отсутствует единое мнение о векторе изменений определенных функций фагоцитов при ХПН в связи с повышением концентрации ПТГ при вторичном гиперпаратиреозе: исследователи констатируют повышение, снижение или отсутствие изменений адгезии, хемотаксиса, поглотительной и киллинговой способностей. Активация фагоцитов в периферической крови при гиперпаратиреозе может быть связана с повышением внутриклеточной концентрации Ca2+ и сопутствующими изменениями активности внутриклеточных мессенджеров (аденилатциклазы, активация кальцийзависимых мессенджеров - транскрипционных факторов Spi1/PU.1, AP-1/FOS и последующая активация семейства генов кальгранулинов S100-S100A8 и S100A9, генов CCL2 /MCP-1, CD14, FOLR2), интенсивности углеводного обмена, захвата и утилизации кислорода и иными факторами [8]. Большинство исследователей констатируют связь вторичного ГПТ при ХПН с дисфункцией Т- и В-звена иммунитета, прежде всего из-за повышения базального уровня цитозольного кальция [10]. Показательно, что паратиреоидэктомия часто приводит к восстановлению иммунного статуса и нивелированию клинических эквивалентов иммунодефицита.

Применение амлодипина при экспериментальном ГПТ приводит к изменению количественного представительства лейкоцитов в периферической крови. Так, в относительных величинах полностью восстанавливается количество нейтрофилов, лимфоцитов, увеличивается количество моноцитов (табл. 1). При пересчете показателей на абсолютные величины обнаружено восстановление количества лимфоцитов и моноцитов в крови (табл. 2). В условиях применения амлодипина изменяется функциональная активность нейтрофилов в крови (табл. 3). Увеличиваются интенсивность фагоцитоза (в среднем на 48% от значений в контрольной группе) и фагоцитарное число (в среднем на 18%). Амлодипин изменяет показатели генерации активных форм кислорода нейтрофилами - повышается активность спонтанного НСТ-теста, снижается функциональный резерв нейтрофилов, оцениваемый по активности НСТ-теста. Применение амлодипина приводит к увеличению показателей адаптивного иммунитета - восстанавливаются интенсивность реакции ГЗТ и количество АОК в селезенке в пересчете на ЯСК (табл. 4).

Таблица 3

Влияние амлодипина на показатели врожденного иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе (M±m)

Таблица 4

Влияние амлодипина на показатели адаптивного иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе (M±m)

По данным других исследователей, применение при ГПТ таких блокаторов кальциевых каналов, как верапамил, нифедипин, амлодипин и иные, нормализует содержание кальция, АТФ и углеводов в цитоплазме, но только частично восстанавливает функцию фагоцитов [8].

Выводы

1.        При экспериментальном индуцированном диетой гиперпаратиреозе развиваются лимфоцитопения, активация генерации активных форм кислорода нейтрофилами и угнетение Th1-зависимого и Th2-зависимого иммунного ответа. Угнетение Th1-зависимого и Th2-зависимого иммунного ответа прогрессирует по мере снижения количества лимфоцитов в крови.

2.        Применение блокатора кальциевых каналов амлодипина в суммарной дозе 1,75 мг/кг при экспериментальном гиперпаратиреозе приводит к восстановлению количества лимфоцитов в крови и показателей Th1-зависимого и Th2-зависимого иммунного ответа, активации поглотительной способности и снижению функционального резерва генерации активных форм кислорода нейтрофилами.

Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России,                   г. Челябинск;

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России,                    г. Челябинск.