Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,006

ТOPOISOMERASE-2Α AND Е-CADHERIN EXPRESSION IN DIFFERENT BREAST CANCER SUBTYPES AND REPRODUCTIVE STATUSES OF PATIENTS

Shatova Yu.S. 1 Vaschenko L.N. 1 Novikova I.A. 1 Zlatnik E.Yu. 1 Vladimirova L.Yu. 1 Ulyanova E.P. 1 Komova E.A. 1 Chernikova E.N. 2 Mashurova S.A. 3
1 Rostov Research Institute of Oncology
2 Rostov Research Institute of Oncology
3 Regional Consultive Diagnostic Center
Detection of new immunohistochemical markers allows specifying the different breast cancer subtypes and personalization of the treatment. Topoisomerase 2α and E-cadherin expression were determined by immunohistochemical methods in tumors of 95 patients with different breast cancer subtypes and ovarian function. The maximal levels of topoisomerase 2α positive cells were found in Her2neu+ subtype in comparison with triple negative, luminal A and luminal B subtypes while E-cadherin expression was similar in all the subtypes. In postmenopausal patients both markers were highly expressed. In perimenopausal patients topoisomerase 2α demonstrated low expression and E-cadherin the high one. In tumors of patients with normal ovarian function E-cadherin expression was shown to be the lowest of all the groups and topoisomerase 2α expression was moderate. Thus some peculiarities of topoisomerase 2α and E-cadherin expression in patients with various breast cancer subtypes and reproductive statuses were shown.
breast cancer
topoisomerase 2α
E-cadherin
Как свидетельствуют исследования последних лет, рак молочной железы (РМЖ) является гетерогенным заболеванием [4]. Выявление новых иммунногистохимических маркеров и оценка их прогностического значения позволяют уточнить характеристики различных подтипов РМЖ [2] и индивидуализировать тактику лечения больных [4]. Топоизомераза-2-альфа (Topo2α) и Е-кадгерин участвуют в таких важных процессах, как регуляция клеточного цикла, сигнальной трансдукции, адгезия, дифференцировка и миграция опухолевых клеток. Данные литературы о зависимости частоты и уровня экспрессии этих маркеров от биологического подтипа РМЖ противоречивы. Так, по данным одних авторов, частота гиперэкспрессии Topo2α составляет 36-61,4% и повышается при р53+ и высокой степени злокачественности вне зависимости от биологического подтипа РМЖ; другие авторы сообщают о выявлении Topo2α+ у 93,1% Her2neu+ больных [5]. В исследовании, выполненном на группе больных с Her2neu+ метастатическим РМЖ, помимо связи Topo2α+ и Her2neu+, показана ассоциация Topo2α+ с PIK3CA и положительными рецепторами эстрогенов, а добавление в план лечения, помимо Трастузумаба, антрациклинов улучшает результаты лечения у Topo2α+ больных [6]. Значимость Е-кадгерина показана при изучении различных злокачественных опухолей и связана с его свойствами супрессора опухолевого роста и инвазивности (желудка, легкого, шейки матки, молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря) [1]. Однако в исследовании на материале 98 больных РМЖ показано, что прогностическая значимость этого маркера сомнительна. Тем не менее выявлена его корреляция со степенью дифференцировки опухоли и отсутствием метастазов в регионарных лимфоузлах [8]. Экспрессия Е-кадгерина описана как фактор положительного прогноза выживаемости больных РМЖ, особенно при тройном негативном раке (ТНР) [7], хотя именно он характеризуется неблагоприятным течением. Установлено значительное подавление экспрессии Е-кадгерина у больных с мультицентрическим ростом РМЖ в сравнении с уницентрическим [10], причем, по мнению авторов, с этим связан его негативный прогноз. Проведение корреляционного анализа экспрессии Е-кадгерина и рецепторов андрогенов показало, что при ТНР с увеличением уровня экспрессии рецепторов андрогенов (РА) экспрессия Е-кадгерина снижается, а профиль опухоли РА+/Е-кадгерин говорит о повышенном риске рецидивирования и метастазирования [9].

Таким образом, литературные данные о значимости Е-кадгерина и Topo2α+ при различных биологических подтипах РМЖ разрознены и противоречивы; кроме того, остается неисследованной экспрессия этих маркеров у больных РМЖ при их различном репродуктивном статусе, что может играть роль в течении заболевания и ответа опухоли на терапию с учетом связи обоих маркеров с экспрессией рецепторов к гормонам.

Цель исследования: изучить экспрессию маркеров Topo2α+ и Е-кадгерина при различных биологических подтипах РМЖ и при различном репродуктивном статусе больных.

Материалы и методы

Была изучена экспрессия маркеров Topo2α и Е-кадгерина в клетках РМЖ 95 пациенток с различными молекулярно-биологическими подтипами с помощью иммуногистохимического (ИГХ) анализа, который проводили на срезах с парафиновых блоков опухолей, удаленных при операции и предназначенных для стандартного морфологического исследования. Использованные в работе первичные антитела и их разведения представлены в таблице 1.

Таблица 1

Панель использованных для ИГХ-анализа антител

Специфичность

Клон

Фирма

Разведение

Буфер для «демаскировки антигенов»

Topo2α

SWT 3D1

DCS

1:25

10 мМTris, 1 мМEDTA (рН 6,0)

Е-кадгерин

NCH-38

DAKO

1:100

10 мМTris, 1 мМEDTA (рН 6,0)

Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-Link Thermo. Протокол включал в себя предварительный нагрев до 650С, восстановление антигена в течение 20 мин при температуре 970С и дальнейшее охлаждение до 650С. Затем стекла промывались в течение 1-3 мин TBS-буфером (Dako) и помещались в автостейнер ThermoScientific для окрашивания в автоматическом режиме. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали систему детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB DetectionSystem. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, для заключения использовали бальзам Bio-Mount. Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением х10, х20, х40. Для рецепторов Topo2α оценивали количество опухолевых клеток, положительных по ядерной экспрессии данного маркера, и подсчитывали количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения. Для Е-кадгерина оценивали количество клеток, положительных по мембранной экспрессии данного маркера, учитывали выраженность реакции: 0 - отсутствие реакции, 1 - слабая реакция, 2 - умеренная реакция, 3 - сильная реакция; кроме того, обращали внимание на полное или неполное мембранное окрашивание, а также наличие цитоплазматического окрашивания. Статистическую обработку результатов проводили параметрическими и непараметрическими методами (t-критерий Стьюдента, критерий Уилкоксона).

Результаты и обсуждение

Из 95 пациенток у 26 (27,4%) был определен люминальный А подтип, у 33 (34,7%) - люминальный В подтип, у 15 - Her2neu+ (15,8%), у 21 - ТНР (22,1%). 31 больная имела сохранную овариально-менструальную функцию, 45 находились в постменопаузе, 19 - в перименопаузе.

Окрашивание ядер опухолевых клеток антителами к Topo2α отмечено при всех исследованных подтипах РМЖ. Как видно из таблицы 2, содержание положительно окрашенных клеток было максимальным при Her2+ подтипе, при TНР и при люминальном В подтипах РМЖ оно было статистически значимо ниже, а при люминальном А подтипе выявлено слабое окрашивание антителами к топоизомеразе 2α в ядрах единичных опухолевых клеток.

Таблица 2

Экспрессия Topo2α и Е-кадгерина у больных с различными биологическими подтипами РМЖ (%)

ИГХ-маркеры

Биологические подтипы РМЖ

Люминальный А (n=26)

Люминальный В (n=33)

Her2neu+ (n=15)

ТНР (n=21)

Topo2α

Единичные клетки*

36,7±3,3*

77,5±7,5

52,5±7,5*

Е-кадгерин

100

87,5±3,3

80,1±2,8

84,6±3,6

*- различия достоверны в отношении Her2neu+ подтипа (p<0,05)

Позитивная реакция с антителами к Е-кадгерину наблюдалась при всех биологических подтипах РМЖ либо на мембране опухолевых клеток, либо в виде диффузного окрашивания цитоплазмы, в некоторых случаях отмечался смешанный (мембранно-цитоплазматический) характер окрашивания. Экспрессия маркера наблюдалась во всех клетках опухоли или в фокусах опухолевых клеток. Люминальный А подтип характеризовался 100%-ным полным интенсивным окрашиванием мембраны опухолевых клеток. При люминальном В подтипе среднее содержание положительно окрашенных клеток антителами к Е-кадгерину составило 87,5±3,3% с разбросом от 75% до 95%. В 48,5% (16 из 33) случаев наблюдалось полное интенсивное окрашивание мембраны опухолевых клеток, в 36,4% (12 из 33) случаев имел место смешанный характер окрашивания и 5 случаев (15,1%) характеризовались диффузным окрашиванием цитоплазмы. При TНР и Her2neu+ подтипах РМЖ в 100% случаев выявлено умеренное окрашивание мембраны опухолевых клеток с наличием слабого диффузного окрашивания цитоплазмы. При TНР РМЖ антителами к Е-кадгерину окрашивались 84,6±3,6% опухолевых клеток, при Her2neu+ 80,1±2,8%. Достоверной разницы в значении этого показателя при различных подтипах РМЖ не выявлено (табл. 2). Отмечено снижение интенсивности окрашивания мембраны и появления цитоплазматического окрашивания при люминальном В, TНР и Her2+ молекулярных подтипах по сравнению с люминальным А.

Как видно из таблицы 3, уровень экспрессии Topo2α существенно различается в опухолях больных с различной сохранностью овариально-менструальной функции. Минимальные значения отмечаются в опухолях женщин в перименопаузе, при сохранной репродуктивной функции показатели были средними, а в опухолях женщин в постменопаузе  - максимальными, статистически достоверно превышающими показатели остальных групп (p<0,05).

Таблица 3

Экспрессия Topo2α и Е-кадгерина у больных РМЖ с различным репродуктивным статусом (%)

ИГХ-маркеры

Репродуктивный статус

Сохранная функция (n=31)

Перименопауза (n=19)

Постменопауза

(n=45)

Topo2α

50,0±3,3*¹

28,3±4,9*²

77,5±2,5¹

Е-кадгерин

73,3±2,2

98,0±2,0²

95,0±3,5²

*- различия достоверны в отношении постменопаузы; ¹ - различия достоверны в отношении перименопаузы; ² - различия достоверны в отношении группы с сохранной репродуктивной функцией (p<0,05)

Уровень экспрессии Е-кадгерина был высок во всех группах, но в опухолях женщин с сохранной репродуктивной функцией он был достоверно ниже, чем в других (табл. 3). При этом у 20 пациенток (64,5%) отмечалось полное интенсивное окрашивание мембран клеток, у 11 (35,5%) - неполное окрашивание средней интенсивности. В опухолях женщин в пост- и перименопаузе полное интенсивное окрашивание клеточной мембраны отмечалось только в 25% и 33,3% случаев соответственно, т.е. опухоли женщин репродуктивного периода отличались не только уровнем экспрессии Е-кадгерина, но характером клеточной реакции.

Заключение

Таким образом, установлена более высокая экспрессия Topo2α в Her2neu+ опухолях по сравнению с опухолями других подтипов, а экспрессия Е-кадгерина в опухолях разных подтипов достоверно не отличалась. Полученные данные позволяют уточнить иммуногистохимические профили различных биологических подтипов РМЖ. Кроме того, они подтверждают полученные нами ранее данные об «особой» иммуногистохимической картине и микроокружения Her2neu+ опухолей [2, 3], что в свою очередь позволит в дальнейшем расширить и индивидуализировать тактику лечения этих пациенток. Экспрессия исследованных маркеров у женщин с разным репродуктивным статусом имеет ряд различий. Опухоли больных репродуктивной группы характеризовались умеренным уровнем экспрессии Topo2α и более низким уровнем по сравнению с другими Е-кадгерина; в перименопаузе отмечен низкий уровень экспрессии Topo2α и высокий Е-кадгерина, а в опухолях женщин, находящихся в постменопаузе, наблюдался высокий уровень экспрессии обоих маркеров. Итак, показаны особенности экспрессии Topo2α и Е-кадгерина при различных биологических подтипах РМЖ, а также при различном репродуктивном статусе больных.

Рецензенты:

Шихлярова А.И., д.б.н.,  профессор, рук. лабораторией изыскания новых противоопухолевых средств ФГБУ «РНИОИ» Минздрава РФ, г. Ростов-на-Дону;

Франциянц Е.М., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «РНИОИ» Минздрава РФ, г. Ростов-на-Дону.