Целью настоящей работы стало изучение мочеобразовательной функции почек при гипокальциемии, вызванной введением кальцитонина на фоне острой почечной недостаточности.
Материал и методы исследования. Для решения поставленной цели были сформулированы и решались следующие задачи.
- Создание токсической почечной недостаточности по G. Greven (внутримышечное введение 50,0%-ного глицерина в дозе 0,8 мл/100 г 30 крысам линии Вистар после суточного лишения их пищи и воды). Нашей модификацией этой модели для снижения гибели животных являлось то, что дозу вводили не в одну, а в обе задние лапы [4].
- Создание на 20 крысах линии Вистар модели гипокальциемии путем подкожного введения кальцитонина, в качестве которого использовали аптечный препарат миакальцик (Novartis Pharma, Швейцария) - синтетический аналог гормона лосося, обладающий более высоким сродством к рецепторам, действующий сильнее и продолжительнее, в дозе 6 МЕ/кг (1 МЕ соответствует 0,2 мкг кальцитонина), который вводили утром и вечером (12 МЕ/сут/кг) в течение 14 дней. Одни авторы [1] вводят миакальцик в дозе 0,6 МЕ/100 г один раз в день, другие [6] в большей дозе - 2,0 мкг/кг, что равно 10 МЕ/кг, а в инструкции по применению кальцитонина лосося указано, что крысам линии Sprague-Dawley и Fisher 344 его вводили в течение года в дозах от 20 до 80МЕ/кг/сут, что вызывало аденому гипофиза.Выбор нами двукратного в течение суток введения миакальцика был обусловлен более длительным поддержанием в крови его гипокальциемического эффекта, который наступает через 30 мин и длится до 1,5 ч (период полувыведения препарата). При однократном введении его способность снижать уровень кальция в крови будет не столь продолжительна, и, возможно, произойдет ослабление эффекта препарата или даже нормализация содержания кальция в крови.
- Одновременное создание на 20 крысах линии Вистар токсического поражения почек и гипокальциемии.
Контрольную группу составляли 15 крыс линии Вистар, получавших инъекции физиологического раствора в количестве, эквивалентном вводимому миакальцику. На протяжении двух недель опытов все животные имели свободный доступ к пище и воде, которые перед началом экспериментов для предотвращения гидратации и наполнения желудка убирались из клеток за 30-40 мин. В дневное время суток виварий был затемнен, что является естественным для крыс, ведущих ночной образ жизни.
Во всех группах крыс (контрольных, после раздельного введения глицерина и миакальцика и при их совместном введении) эксперименты проводили на 7-й и 14-й дни, когда животных на 6 ч помещали в клетки для сбора мочи, в которой определяли содержание эндогенного креатинина по методу, основанному на реакции Яффе (изменение окраски пикриновой кислоты при взаимодействии с креатинином в щелочной среде) для последующего, после определения уровня креатинина в крови (мкмоль/л), расчета скорости клубочковой фильтрации (мл/час/100 г) и величины канальцевой реабсорбции воды (%). Объемную скорость почечного кровотока (мл/мин) определяли с помощью ультразвукового флуометра Transonic НТ313 (США). О степени протеинурии (мкг/мл) и содержании общего белка в плазме крови (г/л) судили по результатам, полученным методом Лоури и биуретовым методом [5]. Концентрацию кальция в плазме крови (ммоль/л) как доказательство состоявшейся гипокальциемии определяли с помощью эриохрома синего [5]. Содержание натрия в слоях ткани почек определяли методом плазменной фотометрии (ПФА 378, «Юнико-СИС», Россия), а мочевины - наборами Лахема (Чехия). Все биохимические исследования проводили спектрофотометрически (UNICO 800, США). Вывод части животных из эксперимента на 7-й и 14-й дни (по 5 крыс во всех исследуемых группах) происходил с соблюдением Приказа Минздравсоцразвития России № 708н от 23 августа 2010 г. «Об утверждении Правил лабораторной практики» в состоянии обезболивания и сна после внутрибрюшинного введения крысам анестетика общего действия «Золетил» (Франция) в дозе 0,1-0,15 мл/100 г.
Полученные результаты статистически обрабатывались с помощью программы «GraphPad Prizm 5.04», достоверность отличий оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента для параметрического метода сравнения средних величин.
Результаты и их обсуждение. С учетом того, что мы ставили перед собой цель выяснения влияния гипокальциемии на водовыделительную функцию почек в условиях токсического поражения, то посчитали необходимым начать описательную часть с содержания кальция в плазме крови в дни опытов. Введение миакальцика вызвало снижение уровня кальция с контрольного уровня в 2,32±0,19 ммоль/л до 2,06±0,13 ммоль/л на 7-й день, а на 14-й день введения - до 1,87±0,15 ммоль/л (р˂0,02). Следовательно, все результаты состояния водовыделительной функции почек при токсическом поражении почек можно однозначно констатировать как происходящие при гипокальциемии.
Ранее нами было показано [3], что введение крысам глицерина вызвало статистически значимое (р˂0,002) снижение спонтанного диуреза в результате уменьшения скорости клубочковой фильтрации на 21,8% (р<0,05) и на 43,5% (р˂0,001) соответственно. Причиной этого было ослабление объемной скорости почечного кровотока с 10,24±0,68 мл/мин (контроль) до 8,08±0,73 мл/мин (р˂0,05) на 7-й день и до 6,94±0,52 мл/мин (р<0,002) на 14-й день после введения нефротоксиканта. При этом к концу 2-й недели уровень креатинина в плазме крови повысился до 84,25±3,23 мкмоль/л (р˂0,01), и одновременно, причем уже на 7-й день, появилась протеинурия, которая на 14-й день была значительно больше контроля (табл. 1).
Созданная введением миакальцика гипокальциемия вызвала повышение спонтанного шестичасового диуреза с контрольного уровня в 0,19±0,01 мл/час/100 г на 42,1% (р˂0,002) на 7-й день, и еще значительней - на 63,1% на 14-й день. Причинами полиурии были как ускорение клубочковой фильтрации, так и снижение канальцевой реабсорбции воды (табл. 1). Однако основным фактором повышения диуреза являлась гломерулярная фильтрация, которая после введения кальцитонина в течение 7 дней превышала контроль на 50,0% (р˂0,002), а после 14 дней - на 64,3% (р˂0,001). Изменение фильтрации было обусловлено соразмерным ускорением объемной скорости почечного кровотока (до 14,86±0,85 мл/мин и 16,25±1,12 мл/мин на 7-й и 14-й дни постановки экспериментов соответственно).
Таблица 1
Показатели функции почек у крыс при токсическом поражении почек при отдельном введении кальцитонина и на фоне токсического поражения почек
Условия опытов |
Стат. показат. |
Диурез (мл/час/100г) |
Клубочковая фильтрация (мл/час/100г) |
Канальцевая реабсорбция (%) |
Протеинурия (мкг/мл) |
||
Контроль |
M±m |
0,19±0,01 |
12,83±0,94 |
98,88±0,07 |
6,35±0,58 |
||
При токсическим поражение почек |
|||||||
на 7-й день после введения глицерина |
M±m |
0,14±0,015 |
10,16±0,72 |
98,62±0,14 |
11,12±0,98 |
||
Рконт. |
<0,02 |
˂0,05 |
* |
<0,05 |
|||
на 14-й день после введения глицерина |
M±m |
0,12±0,009 |
7,25±0,46 |
98,67±0,12 |
20,04±1,86 |
||
Рконт. |
<0,001 |
<0,001 |
* |
<0,001 |
|||
При гипокальциемии |
|||||||
введение кальцитонина в течение 7 дней |
M±m |
0,27±0,02 |
19,25±1,70 |
98,59±0,08 |
10,25±0,84 |
||
Рконт. |
˂0,002 |
˂0,002 |
<0,05 |
<0,001 |
|||
введение кальцитонина в течение 14 дней |
M±m |
0,31±0,02 |
21,08±1,77 |
98,53±0,07 |
12,58±1,07 |
||
Рконт. |
<0,001 |
<0,001 |
˂0,01 |
˂0,001 |
|||
При гипокальциемии на фоне токсического поражения почек |
|||||||
на 7-й день после введения глицерина и кальцитонина в течение 7 дней |
M±m |
0,21±0,02 |
15,37±1,12 |
98,63±0,11 |
15,25±1,18 |
||
Рконт. |
* |
* |
* |
˂0,001 |
|||
Рглиц./Ргк. |
˂0,002/˂0,01 |
˂0,001/˂0,05 |
* // * |
˂0,02 // ˂0,01 |
|||
на 14-й день после введения глицерина и кальцитонина в течение 14 дней |
M±m |
0,24±0,02 |
17,09±1,50 |
98,59±0,14 |
22,65±1,34 |
||
Рконт. |
˂0,01 |
˂0,001 |
* |
˂0,001 |
|||
Рглиц./Ргк. |
˂0,001/˂0,05 |
˂0,001/˂0,05 |
* // * |
* // ˂0,002 |
* - отсутствие статистически значимых отличий, Рконт., Рглиц., Ргк. - сравнение с данными контроля токсического поражения почек глицерином и полученными при гипокальциемии
Содержание креатинина в плазме крови как после семикратного (75,64±3,08 мкмоль/л), так и двухнедельного (78,36±3,45 мкмоль/л) введения кальцитонина, несмотря на тенденцию к повышению, не имело статистически значимого отличия от контроля (72,64±2,28 мкмоль/л), в то время как уровень белка в моче достоверно (р˂0,001) превышал норму, особенно после двухнедельного введения - почти в 2 раза (табл. 1).
При создании гипокальциемии на фоне токсического поражения почек водовыделительная функция почек отличалась от данных и при глицериновом поражении почек, и при гипокальциемии. В этом варианте на 7-й день постановки экспериментов основные процессы мочеобразования не имели достоверного отличия от контроля, но по сравнению с результатами, полученными после рабдомиолизного поражения почек, диурез и скорость клубочковой фильтрации у крыс были на 50,0% и 51,3% больше (р˂0,001), а по сравнению с гипокальциемическим состоянием - наоборот, на 22,3% и 21,2% меньше (р˂0,01). Канальцевая реабсорбция не менялась (табл. 1). В опытах, поставленных на 14-й день, эта направленность изменений диуреза и клубочковой фильтрации сохранилась, и при этом еще появились статистически значимые отличия от контроля (табл. 1). Что касается содержания креатинина в плазме крови, то оно было больше, чем при отдельном глицериновом поражении почек и при гипокальциемии (85,64±3,85 мкмоль/л на 7-й день и 92,46±3,12 мкмоль/л на 14-й день). Аналогичное отличие наблюдалось и в степени протеинурии (табл. 1).
Так как при расчете канальцевой реабсорбции воды было выявлено ее статистически значимое снижение при гипокальциемии, то мы посчитали необходимым исследовать в слоях ткани почек содержание мочевины и натрия как основных осмотически активных веществ, создающих давление в интерстициальной почечной ткани и способных оказывать влияние на обратное всасывание воды в канальцах. Проведенные исследования показали снижение содержания мочевины во всех слоях ткани почек, а натрия - только в корковом и мозговом веществах (табл. 2).
Таблица 2
Содержание мочевины (мкмоль/г влажного веса) и натрия (мкмоль/г сухого веса) в слоях ткани почек крыс с гипокальциемией
Условия опытов и исследуемые вещества |
Стат. показат. |
Корковое вещество |
Мозговое вещество |
Почечный сосочек |
|
Контроль |
Мочевина |
M±m |
30,82±1,22 |
67,75±2,87 |
202,38±6,02 |
Натрий |
27,86±0,82 |
44,94±1,35 |
95,12±2,65 |
||
При гипокальциемии |
|||||
введение кальцитонина в течение 7 дней |
Мочевина |
M±m |
26,92±0,85 |
59,21±1,66 |
184,26±4,93 |
Рконт. |
˂0,02 |
˂0,02 |
˂0,05 |
||
Натрий |
M±m |
23,55±0,68 |
39,75±1,74 |
88,76±3,87 |
|
Рконт. |
˂0,01 |
˂0,05 |
* |
||
введение кальцитонина в течение 14 дней |
Мочевина |
M±m |
25,57±1,06 |
57,34±2,18 |
181,37±4,56 |
Рконт. |
˂0,01 |
˂0,01 |
˂0,02 |
||
Натрий |
M±m |
22,94±0,84 |
38,48±2,02 |
86,92±4,85 |
|
Рконт. |
˂0,002 |
˂0,05 |
* |
* - отсутствие статистически значимых отличий
При этом уменьшение содержания этих веществ, несмотря на статистически значимые отличия, было не столь значительным - в среднем от 10% (на 7-й день) до 18% (на 14-й день). Поэтому и ослабление канальцевой реабсорбции воды было также не столь значительным (табл. 1).
Таким образом, токсическое глицериновое поражение почек в течение двух недель характеризуется протеинурией, снижением спонтанного диуреза и ослаблением клубочковой фильтрации. Экспериментальная гипокальциемия, созданная ежедневным в течение двух недель введением кальцитонина, также вызывает протеинурию, но повышает диурез вследствие ускорения клубочковой фильтрации и торможения канальцевой реабсорбции воды в результате уменьшения осмотического давления в интерстиций слоев ткани почек. Двухнедельное введение кальцитонина на фоне токсического поражения почек снимает вызванное введением глицерина торможение диуреза и угнетение скорости клубочковой фильтрации, но усиливает степень протеинурии.
Рецензенты:
Брин В.Б., д.м.н., профессор, ГБОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Владикавказ;
Болиева Л.З., д.м.н., профессор, ГБОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Владикавказ.