Создание отечественных препаратов на основе сырья природного происхождения является актуальной задачей фармации. Особое значение в этом плане имеет изучение сапропеля как возобновляемого ресурса с высоким лечебно-профилактическим потенциалом. Сапропель распространён в качестве донных отложений в пресноводных водоёмах различных регионов России. Основными биологически активными соединениями представленного образования являются гуминовые вещества. При этом строение и свойства гуминовых веществ находятся в полной зависимости от места происхождения. Следует отметить, что технологические факторы в свою очередь способствуют их изменчивости в плане структуры, полноты извлечения, биодоступности и биологической активности [3,4].

В настоящее время доказано, что гуминовые кислоты являются гетерогенными и полидисперсными соединениями, для которых не установлено точное значение молекулярной массы, в связи с чем невозможно провести количественное определение гуминовых соединений как индивидуальных веществ[4,9]. Согласно данным литературы, биологическая активность гуминовых веществ во многом определяется количеством функциональных групп кислотного характера[1,4].

В связи с чем целью данной работыявилась разработка и валидация методики количественного определения гуминовых веществ активированных методом Боэма для включения метода в нормативную документацию, регламентирующую качество выделенных соединений.

Материалы и методы исследования. Объектами исследования явились гуминовые вещества, выделенные из сапропеля озера Горчаково Тюкалинского района Омской области и подвергнутые фотохимической активации на стадии выделения – гуминовые вещества активированные (ГВА).Извлечение ГВА проводили по методике, приведенной в работе [6].

            Количественное определение функциональных группв молекулах гуминовых веществ проводили по методике Боэма с кондуктометрической фиксацией конечной точки титрования на лабораторном анализаторе «Мультитест КСЛ» (НПП Семико, Россия) при температуре 20±2оС, представленной в работе [5].

Методика количественного определенияГВА: 0,25 г гуминовых веществ активированных помещали в мерную колбу на 500 мл, растворяли в 100 мл 0,01 М раствора натрия гидрокарбоната и доводили объем раствора тем же растворителем до метки. Полученный раствор встряхивали на продольном встряхивателе в течение 30 мин и фильтровали через плотный бумажный фильтр для тонких осадков. Затем 25 мл фильтрата при постоянной температуре раствора 25±1°С титровали 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной и определяли показатель удельной электропроводности в конечной точке титрования.

Массовую концентрацию гуминовых веществ активированных определяли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала удельной электропроводности (мСм/м), рассчитанного при титровании карбоксильных функциональных групп методом Боэма, от массы навески гуминовых веществ. Количественное содержание гуминовых веществ активированных в процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье рассчитывали по формуле:

    (1) , где

а – масса гуминовых веществ активированных в граммах, найденная по калибровочному графику;

а1– масса навески гуминовых веществ активированных в граммах, взятая для испытания;

W–потеря в массе при высушивании гуминовых веществ активированных в процентах.

Построение калибровочного графика.1,0 г гуминовых веществ активированных – стандартного образца, высушенных до постоянной массы, помещали в мерную колбу на 500 мл, растворяли в 100 мл 0,01 М раствора натрия гидрокарбоната и доводили объем раствора тем же растворителем до метки. Из этого раствора готовили серию разбавленных растворов, содержащих гуминовых веществ соответственно 0,0025; 0,005; 0,0075; 0,01; 0,0125 г в 25 мл раствора. Полученные растворы встряхивали на продольном встряхивателе в течение 30 мин и фильтровали через плотный бумажный фильтр для тонких осадков, затем при постоянной температуре раствора 25±1°С титровали 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной и определяли показатель удельной электропроводности в конечной точке титрования.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы Statistica 6.0 forWindows для доверительной вероятности 0,95.

Результаты и их обсуждение

Ранее проведенные исследования показали возможность применения метода Боэма для количественного определения содержания карбоксильных, лактонных и гидроксильных групп в гуминовых веществах. Для включения предложенного метода в нормативную документацию, характеризующую качество гуминовых веществ активированных, оптимальная концентрация растворов, необходимая для проведения испытаний, рекомендуется в линейном диапазоне от 0,01 до 0,05%[5,7].

Нами разработана методика количественного определения активированных гуминовых веществ, основанная на зависимости показателя удельной электропроводности растворов исследуемых соединений от количества карбоксильных функциональных групп. Карбоксильные группы титруются самостоятельно, а не суммарно с другими функциональными группами кислотного характера, поэтому именно по ним проводилась разработка методики количественного определения ГВА.

Следует отметить, что для количественного определения функциональных групп в молекулах гуминовых веществ предлагаемый метод является наиболее приемлемым, так как характеризуется высокой экспрессностью, простотой, доступностью измерительных приборов и достаточной точностью. Однако актуальной остается проблема измерения единиц концентрации. Для включения данного метода в нормативную документацию, регламентирующую качество гуминовых веществ, необходимо использовать единицы измерения концентрации гуминовых соединений, принятые в фармацевтическом анализе.

При разработке методики в качестве рабочего стандартного образца (РСО) использовали высокоочищенные гуминовые вещества активированные, отвечающие требованиям технических условий [8].

При определении карбоксильных функциональных групп методом Боэма были последовательно зарегистрированы сигналы удельной электропроводности растворов РСО гуминовых веществ активированных в порядке возрастания их концентрации в конечной точке титрования.Для исключения случайных результатов и усреднения данных выполняли три последовательных измерения для каждого из градуировочных растворов. В табл. 1 приведены усреднённые значения удельной электропроводности данных образцов.

Таблица 1

Показатели удельной электропроводности РСО гуминовых веществ активированных в конечной точке титрования при определении карбоксильных групп

 

На основании полученных результатов был построен градуировочный график зависимости удельной электропроводности растворов РСО гуминовых веществ активированных в конечной точке титрования от взятой навески гуминовых соединений (рисунок).

Градуировочный график зависимости показателя удельной электропроводности растворов РСО ГВА от массы навески

Количественное содержание исследуемых ГВА в процентах рассчитывали по формуле (1), используя построенный градуировочный график зависимости выходного сигнала удельной электропроводности (мСм/м) от массовой концентрации РСО гуминовых веществ активированных.

Важнейшим критерием оценки аналитической методики служит доказательство ее валидности, включающей взаимосвязанную систему характеристик – специфичность, линейность, прецизионность(воспроизводимость) и точность.

Специфичность методики определяется химической реакцией, лежащей в основе метода. В данном случае на взаимодействии карбоксильных групп в структуре гуминовых веществ с натрия гидрокарбонатом.

Для обоснования линейной зависимости предлагаемой методики строили градуировочный график зависимости показателя удельной электропроводности растворов РСО ГВА от массы навески, рассчитывали уравнение регрессии и коэффициент корреляции. Данные для расчетов представлены в таблице 1, графическая зависимость отражена на графике (рисунок 1).По оси абсцисс – содержание гуминовых веществ активированных, г; по оси ординат – удельная электропроводность растворов ГВА.В результате установлено, что график имеет линейный характер и описывается уравнением y=240·x + 57,4 при навеске гуминовых веществ активированных от 0,01 до 0,05 г. Коэффициент корреляции (r) равен 0,999, что свидетельствует о линейной связи значения удельной электропроводности растворов гуминовых веществ активированных от массы взятой навески. Это позволяет использовать данную методику для количественного определения гуминовых веществ активированных в диапазоне концентраций0,01-0,05%.

Статистическая обработка результатов количественного определения гуминовых веществ активированных представлена в табл. 2.

Таблица 2

Метрологическая характеристика методики количественного определения гуминовых веществ активированных

 

Результаты анализа образцов показали, что содержание гуминовых веществ активированных в исследуемой субстанции составляет 97,78 ± 1,1%.

Для установления прецизионности (воспроизводимости) проводили 7 параллельных определений, затем вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD) (табл. 3).

Таблица 3

Результаты анализапрецизионности методики количественного определения исследуемых гуминовых веществ активированных

 

В разработанной методике величина относительного стандартного отклонения менее 5%, что характеризует надежность анализа в выбранных условиях [2].

Точность аналитической методики количественного определения подтверждалась на всем диапазоне применения. Оценка проводилась путем сравнения полученного результата с ожидаемым значением. Для определения точности методики проанализировали 9 образцов на 3 уровнях концентраций в пределах аналитической области.В результате получены 9 значений открываемости(R), для которых вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD) (табл.4).

Таблица 4

Результаты определения точности методики количественного определения гуминовых веществ активированных

 

Анализ результатов определения точности методики показал, что теоретические и экспериментальные значения количественного содержания гуминовых веществ активированных практически полностью совпадают. Величина относительного стандартного отклонения (RSD) не превышает 5%, а открываемость R составляет в среднем 99,63%, что характеризует точность методики как удовлетворительную [2]. В связи с чем в проект фармакопейной статьи предприятия, регламентирующий качество активированных гуминовых веществ, заложен показатель количественного содержания ГВА не менее 95%.

Заключение.Таким образом, установлено, что предлагаемая методика количественного определения гуминовых веществ активированных является специфичной, воспроизводимой, точной и линейной в диапазоне концентраций 0,01-0,05%, что позволяет рекомендовать разработанную методику для контроля качества гуминовых веществ активированных, как источника для получения лекарственных средств.

Рецензенты:

Степанова И.П., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой химии ГБОУ ВПО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Омск;

Кривцова Л.А., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой педиатрии ПДО ГБОУ ВПО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава России, г.Омск.