В настоящее время доказано, что гуминовые кислоты являются гетерогенными и полидисперсными соединениями, для которых не установлено точное значение молекулярной массы, в связи с чем невозможно провести количественное определение гуминовых соединений как индивидуальных веществ[4,9]. Согласно данным литературы, биологическая активность гуминовых веществ во многом определяется количеством функциональных групп кислотного характера[1,4].
В связи с чем целью данной работыявилась разработка и валидация методики количественного определения гуминовых веществ активированных методом Боэма для включения метода в нормативную документацию, регламентирующую качество выделенных соединений.
Материалы и методы исследования. Объектами исследования явились гуминовые вещества, выделенные из сапропеля озера Горчаково Тюкалинского района Омской области и подвергнутые фотохимической активации на стадии выделения – гуминовые вещества активированные (ГВА).Извлечение ГВА проводили по методике, приведенной в работе [6].
Количественное определение функциональных группв молекулах гуминовых веществ проводили по методике Боэма с кондуктометрической фиксацией конечной точки титрования на лабораторном анализаторе «Мультитест КСЛ» (НПП Семико, Россия) при температуре 20±2оС, представленной в работе [5].
Методика количественного определенияГВА: 0,25 г гуминовых веществ активированных помещали в мерную колбу на 500 мл, растворяли в 100 мл 0,01 М раствора натрия гидрокарбоната и доводили объем раствора тем же растворителем до метки. Полученный раствор встряхивали на продольном встряхивателе в течение 30 мин и фильтровали через плотный бумажный фильтр для тонких осадков. Затем 25 мл фильтрата при постоянной температуре раствора 25±1°С титровали 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной и определяли показатель удельной электропроводности в конечной точке титрования.
Массовую концентрацию гуминовых веществ активированных определяли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала удельной электропроводности (мСм/м), рассчитанного при титровании карбоксильных функциональных групп методом Боэма, от массы навески гуминовых веществ. Количественное содержание гуминовых веществ активированных в процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье рассчитывали по формуле:
(1) , где
а – масса гуминовых веществ активированных в граммах, найденная по калибровочному графику;
а1– масса навески гуминовых веществ активированных в граммах, взятая для испытания;
W–потеря в массе при высушивании гуминовых веществ активированных в процентах.
Построение калибровочного графика.1,0 г гуминовых веществ активированных – стандартного образца, высушенных до постоянной массы, помещали в мерную колбу на 500 мл, растворяли в 100 мл 0,01 М раствора натрия гидрокарбоната и доводили объем раствора тем же растворителем до метки. Из этого раствора готовили серию разбавленных растворов, содержащих гуминовых веществ соответственно 0,0025; 0,005; 0,0075; 0,01; 0,0125 г в 25 мл раствора. Полученные растворы встряхивали на продольном встряхивателе в течение 30 мин и фильтровали через плотный бумажный фильтр для тонких осадков, затем при постоянной температуре раствора 25±1°С титровали 0,01 М раствором кислоты хлористоводородной и определяли показатель удельной электропроводности в конечной точке титрования.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы Statistica 6.0 forWindows для доверительной вероятности 0,95.
Результаты и их обсуждение
Ранее проведенные исследования показали возможность применения метода Боэма для количественного определения содержания карбоксильных, лактонных и гидроксильных групп в гуминовых веществах. Для включения предложенного метода в нормативную документацию, характеризующую качество гуминовых веществ активированных, оптимальная концентрация растворов, необходимая для проведения испытаний, рекомендуется в линейном диапазоне от 0,01 до 0,05%[5,7].
Нами разработана методика количественного определения активированных гуминовых веществ, основанная на зависимости показателя удельной электропроводности растворов исследуемых соединений от количества карбоксильных функциональных групп. Карбоксильные группы титруются самостоятельно, а не суммарно с другими функциональными группами кислотного характера, поэтому именно по ним проводилась разработка методики количественного определения ГВА.
Следует отметить, что для количественного определения функциональных групп в молекулах гуминовых веществ предлагаемый метод является наиболее приемлемым, так как характеризуется высокой экспрессностью, простотой, доступностью измерительных приборов и достаточной точностью. Однако актуальной остается проблема измерения единиц концентрации. Для включения данного метода в нормативную документацию, регламентирующую качество гуминовых веществ, необходимо использовать единицы измерения концентрации гуминовых соединений, принятые в фармацевтическом анализе.
При разработке методики в качестве рабочего стандартного образца (РСО) использовали высокоочищенные гуминовые вещества активированные, отвечающие требованиям технических условий [8].
При определении карбоксильных функциональных групп методом Боэма были последовательно зарегистрированы сигналы удельной электропроводности растворов РСО гуминовых веществ активированных в порядке возрастания их концентрации в конечной точке титрования.Для исключения случайных результатов и усреднения данных выполняли три последовательных измерения для каждого из градуировочных растворов. В табл. 1 приведены усреднённые значения удельной электропроводности данных образцов.
Таблица 1
Показатели удельной электропроводности РСО гуминовых веществ активированных в конечной точке титрования при определении карбоксильных групп
|
№ п/п |
Удельная электропроводность, мСм/м |
Концентрация раствора ГВА - стандартного образца, % |
|
1 |
58,0 |
0,01 |
|
2 |
58,6 |
0,02 |
|
3 |
59,2 |
0,03 |
|
4 |
59,8 |
0,04 |
|
5 |
60,4 |
0,05 |
На основании полученных результатов был построен градуировочный график зависимости удельной электропроводности растворов РСО гуминовых веществ активированных в конечной точке титрования от взятой навески гуминовых соединений (рисунок).
Градуировочный график зависимости показателя удельной электропроводности растворов РСО ГВА от массы навески
Количественное содержание исследуемых ГВА в процентах рассчитывали по формуле (1), используя построенный градуировочный график зависимости выходного сигнала удельной электропроводности (мСм/м) от массовой концентрации РСО гуминовых веществ активированных.
Важнейшим критерием оценки аналитической методики служит доказательство ее валидности, включающей взаимосвязанную систему характеристик – специфичность, линейность, прецизионность(воспроизводимость) и точность.
Специфичность методики определяется химической реакцией, лежащей в основе метода. В данном случае на взаимодействии карбоксильных групп в структуре гуминовых веществ с натрия гидрокарбонатом.
Для обоснования линейной зависимости предлагаемой методики строили градуировочный график зависимости показателя удельной электропроводности растворов РСО ГВА от массы навески, рассчитывали уравнение регрессии и коэффициент корреляции. Данные для расчетов представлены в таблице 1, графическая зависимость отражена на графике (рисунок 1).По оси абсцисс – содержание гуминовых веществ активированных, г; по оси ординат – удельная электропроводность растворов ГВА.В результате установлено, что график имеет линейный характер и описывается уравнением y=240·x + 57,4 при навеске гуминовых веществ активированных от 0,01 до 0,05 г. Коэффициент корреляции (r) равен 0,999, что свидетельствует о линейной связи значения удельной электропроводности растворов гуминовых веществ активированных от массы взятой навески. Это позволяет использовать данную методику для количественного определения гуминовых веществ активированных в диапазоне концентраций0,01-0,05%.
Статистическая обработка результатов количественного определения гуминовых веществ активированных представлена в табл. 2.
Таблица 2
Метрологическая характеристика методики количественного определения гуминовых веществ активированных
|
n |
Xср |
S2 |
S |
Sr |
t (0,95) |
Xср ± Δх |
|
10 |
97,78 |
2,37 |
0,648 |
1,57×10-2 |
2,26 |
97,78 ± 1,1 |
Результаты анализа образцов показали, что содержание гуминовых веществ активированных в исследуемой субстанции составляет 97,78 ± 1,1%.
Для установления прецизионности (воспроизводимости) проводили 7 параллельных определений, затем вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD) (табл. 3).
Таблица 3
Результаты анализапрецизионности методики количественного определения исследуемых гуминовых веществ активированных
|
№ п/п |
Найденное содержание гуминовых веществ активированных, % |
Метрологические характеристики |
|
1 |
97,3 |
Xср=97,6 % SD=5,143×10-1 RSD=5,30×10-3 % |
|
2 |
98,4 |
|
|
3 |
96,5 |
|
|
4 |
99,2 |
|
|
5 |
98,6 |
|
|
6 |
96,9 |
|
|
7 |
96,3 |
В разработанной методике величина относительного стандартного отклонения менее 5%, что характеризует надежность анализа в выбранных условиях [2].
Точность аналитической методики количественного определения подтверждалась на всем диапазоне применения. Оценка проводилась путем сравнения полученного результата с ожидаемым значением. Для определения точности методики проанализировали 9 образцов на 3 уровнях концентраций в пределах аналитической области.В результате получены 9 значений открываемости(R), для которых вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD) (табл.4).
Таблица 4
Результаты определения точности методики количественного определения гуминовых веществ активированных
|
№ п/п |
Уровень |
Навеска ГВА, г |
Найденное содержание ГВА, % |
Расчетное содержание ГВА, % |
Открываемость (R),% |
Метрологические характеристики |
|
1 |
1 |
0,0996 |
39,15 |
39,80 |
98,37 |
Rср=99,63% SD=0,279 RSD=2,80×10-3 % |
|
2 |
1 |
0,1011 |
39,95 |
40,40 |
98,88 |
|
|
3 |
1 |
0,1029 |
41,08 |
41,21 |
99,69 |
|
|
4 |
2 |
0,1502 |
59,91 |
60,10 |
99,69 |
|
|
5 |
2 |
0,1508 |
60,24 |
60,30 |
99,90 |
|
|
6 |
2 |
0,1511 |
60,46 |
60,4 |
100,1 |
|
|
7 |
3 |
0,2455 |
98,5 |
98,6 |
99,90 |
|
|
8 |
3 |
0,2491 |
98,6 |
98,6 |
100 |
|
|
9 |
3 |
02498 |
98,7 |
98,6 |
100,1 |
Анализ результатов определения точности методики показал, что теоретические и экспериментальные значения количественного содержания гуминовых веществ активированных практически полностью совпадают. Величина относительного стандартного отклонения (RSD) не превышает 5%, а открываемость R составляет в среднем 99,63%, что характеризует точность методики как удовлетворительную [2]. В связи с чем в проект фармакопейной статьи предприятия, регламентирующий качество активированных гуминовых веществ, заложен показатель количественного содержания ГВА не менее 95%.
Заключение.Таким образом, установлено, что предлагаемая методика количественного определения гуминовых веществ активированных является специфичной, воспроизводимой, точной и линейной в диапазоне концентраций 0,01-0,05%, что позволяет рекомендовать разработанную методику для контроля качества гуминовых веществ активированных, как источника для получения лекарственных средств.
Рецензенты:Степанова И.П., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой химии ГБОУ ВПО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Омск;
Кривцова Л.А., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой педиатрии ПДО ГБОУ ВПО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава России, г.Омск.