Злокачественная опухоль  объемом более 1 мм3 нуждается в собственной системе кровообращения, что дает  неоплазме способность к автономному развитию, а также возможность метастазирования [4]. Основными агентами неоангио- и неолимфогенеза  является семейство факторов роста сосудистого эндотелия (VEGF), представленные VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, осуществляющими свой биологический эффект в результате взаимодействия с тирозинкиназными рецепторами R1, R2 и R3. Физиологический ангиогенез представляет собой ответ либо на гормональную стимуляцию (в репродуктивной системе), либо на изменение в окружающей среде, в частности гипоксию [4]. Исследование VEGF при злокачественных процессах указало на повышение экспрессии этого фактора роста в опухолевых клетках [1]. Процессы неоангио- и неолимфогенеза находятся под воздействием индукторов и ингибиторов, в норме секреция тканевых ингибиторов превалирует над индукторами [2]. С возрастом соотношение половых гормонов, а также баланс эстрогенов меняется, в частности с повышением в тканях эстрона. Следовательно, гормональная регуляция факторов роста и их рецепторов также может претерпевать изменения. Некоторые исследователи полагают, что ангиогенез в нормальных тканях находится под гормональным контролем, а при злокачественной трансформации этот контроль меняется [7]. Считают, что VEGF играет важную роль при раке молочной железы, стимулируя рост и распространение опухоли посредством комплексных паракринных и аутокринных воздействий [1]. Меланома кожи - одно из самых злокачественных онкологических заболеваний, характеризующееся высокой частотой метастазирования. Клетки меланомы способны к синтезу гормонов и факторов роста, в них обнаружены рецепторы стероидных гормонов [3]. Экспериментальные исследования позволяют изучить насыщенность как самой опухоли, так и окружающих ее тканей в процесс роста меланомы, понять процессы, в результате которых происходит нарушение локальных механизмов регуляции нормального клеточного роста.

Целью исследования явилось изучение регуляторной роли различных эстрогенов на экспрессию VEGF-A, VEGF-С, VEGF-R1 и VEGF-R2 в опухоли и окружающих ее тканях на этапах роста перевивной меланомы В16/F10 самцам мышей С57ВL/6. 

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на самцах мышей линии С57ВL/6 (n=40),  8-недельного возраста с начальной массой 24-26 г. Животные были получены из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий «Андреевка» ФМБА (Московская область). В работе использовали клеточную линию мышиной, метастазирующей в легкие меланомы В16/F10. Культура клеток меланомы В16/F10 была  предоставлена РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (г. Москва). Все исследования проводились в соответствии с требованиями и условиями, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей»,  и приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». Животные были разделены на 2 группы (контрольную и опытную) случайным образом: 10 животных в контрольной группе и 30 животных в опытной. Перевивка меланомы В16 производилась путем подкожного введения в правую заднюю лапку мышам опытной группы 0,5 мл взвеси опухолевой ткани в растворе Хенкса (2х105 клеток опухоли в среде 199) по стандартным методикам. Контрольной группе животных вводили 0,5 мл физиологического раствора. В первую, вторую и третью недели эксперимента животных быстро декапитировали и выделяли опухоль, перифокальную зону и неповрежденную кожу. Из тканей получали 10%-ные цитозольные фракции, приготовленные на 0,1М калий-фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 0,1% Твин-20 и 1% БСА, в которых стандартными ИФА методами определяли уровень эстрадиола - Е2, эстриола - Е3, эстрона Е1, тестостерона общей и свободной формы – Тобщ и Тсв, а также VEGF-A, VEGF-C и их рецепторов VEGF-R1 и VEGF-R2. Статистический анализ результатов проводили с помощью пакета  Statistica 6,0 (Stat-Soft, 2001). Оценка достоверности произведена  с использованием t-критерия Стьюдента. Уровень Р<0,05 принимали как значимый.

Результаты исследований представлены на 1, 2 и 3-ю недели после перевивки опухоли В16/F10, когда вес опухоли достигал в среднем 115,7, 4089,3 и 5990 мг соответственно. Полученные результаты исследования уровня гормонов и факторов роста сравнивали с показателями в интактной коже мышей контрольной группы (табл. 1, 2).

Таблица 1

Уровень половых гормонов в опухоли и окружающих ее тканях на этапах роста меланомы В16/F10

Примечание: 1 – достоверно по отношению к показателям в интактной коже р<0,05.

В ткани опухоли в  первую неделю было установлено повышение уровня эстрона в 1,4 раза и снижение эстриола в 1,3 раза на фоне увеличение концентрации VEGF-A и VEGF-C и их рецепторов VEGF-R1 и VEGF-R2 в 8,7,  6,2,  1,9  и  8,2 раза соответственно. Учитывая тот факт, что андрогены являются предшественниками в цепи синтеза эстрогенов, исследовали насыщенность тканей общей и свободной формой тестостерона. В опухоли на первую неделю перевивки было установлено снижение уровня тестостерона в 1,5 раза, а свободной формы в 6,9 раза.

Вторая неделя опухолевого роста характеризовалась еще большим повышением уровня эстрона в меланоме – в 2,1 раза, на фоне снижения концентрации Е2 и Е3 в 1,6 и  2,4 раза соответственно. При этом насыщенность опухоли тестостероном оставалась такой же сниженной, как и в первую неделю – в 1,7 и в 6,9 раза, по сравнению с интактной кожей.

Таблица 2

Факторы роста эндотелия сосудов в опухоли и окружающих ее тканях на этапах роста меланомы В16/F10

Примечание: 1 - достоверно по отношению к показателям в ткани интактных животных; 2 - достоверно по отношению к показателям в предыдущий срок исследования p<0,05.

Во вторую неделю роста меланомы в опухоли отмечен максимальный прирост концентраций: уровень VEGF-A превысил показатели в контрольной группе в 48,5 раза, а показатели в первую неделю – в 5,6 раза; насыщенность опухоли VEGF-C возросла в 25,9 раза по сравнению с интактной кожей и в 4,2 раза по сравнению с показателями в первую неделю. Концентрации рецепторов выросли: VEGF-R1 в 29 раз, а VEGF-R2 в 14,7 раза по сравнению с контролем и в 15 и в 1,8 раза соответственно по сравнению с первой неделей опухолевого роста.

На завершающем этапе роста меланомы, т.е. через 3 недели от момента перевивки,  уровень эстрона в опухоли оставался, как и во вторую неделю эксперимента, повышенным в 2,1 раза по сравнению с контрольной группой. При этом насыщенность эстрадиолом и эстриолом была снижена в 1,6 и в 2,6 раза соответственно. Достоверно снизились показатели общей и свободной формы тестостерона в опухоли по сравнению со второй неделей эксперимента: в 1,6 и в 3,4 раза соответственно. Что касается системы факторов роста, то их концентрации и уровень рецепторов в меланоме не изменился по сравнению с предыдущим сроком исследования, оставаясь выше показателей в контрольной группы: VEGF-A - в 61,8 раза, VEGF-C – в 24,9 раза, VEGF-R1 - в 25,7 раза и VEGF-R2 - в 12,9 раза.

Ближайшим окружением опухоли является ее перифокальная зона. В исследовании были установлены изменения как гормонального уровня, так и насыщенности факторами роста и их рецепторами на протяжении роста меланомы В16/F10. В первую неделю роста меланомы в перифокальной зоне был установлен рост уровня эстриола в 1,7 раза на фоне снижения показателей общего и свободного тестостерона в  1,7 и в 17,2 раза соответственно по сравнению с интактной кожей. При этом концентрация VEGF-A и VEGF-C превысила показатели в интактной коже в 3,7 и в 1,8 раза соответственно. Однако максимальный прирост был установлен в концентрации VEGF-R1 - увеличился в 6,7 раза, в то время как VEGF-R2 - в 2,8 раза. Во вторую неделю эксперимента уровень эстриола в перифокальной зоне оставался повышенным в 1,4 раза, но при этом снизилась концентрация эстрона – в 1,7 раза по сравнению с интактной кожей. Насыщенность перифокальной зоны тестостероном была ниже нормы: в 2,1 раза общей формой и в 8,8 раза – свободной. Уровень VEGF-A в перифокальной зоне увеличился в 1,6 раза по сравнению с предыдущим сроком исследования в 1,6 раза, тогда как VEGF-C - в 9,9 раза. При этом уровень рецепторов оставался таким же, как и в первую неделю исследования, превышая показатели интактной кожи VEGF-R1 в 6,4 раза, а VEGF-R2 в 2,7 раза. В третью неделю роста меланомы насыщенность перифокальной зоны эстроном превысила показатели контрольной группы в 1,6 раза на фоне сниженного в 1,4 раза эстрадиола, уровень эстриола не отличался от контроля. Насыщенность зоны, окружающей меланому, тестостероном оставалась сниженной, в 2,5 раза – общей формой тестостерона и в 34,2 раза – свободной формой андрогена. При этом уровень Тсв. в конце эксперимента была в 3,9 раза ниже, чем во вторую неделю. Насыщенность перифокальной зоны VEGF-A продолжала расти, превышая показатели предыдущего этапа в 4,1 раза, а контрольной группы в 24,9 раза. Насыщенность перифокальной зоны VEGF-C превышала норму в 16,5 раза, не отличаясь от показателей во вторую неделю эксперимента. Уровень VEGF-R1 не имел достоверных отличий от показателей во вторую неделю, превышая норму в 5 раз, а вот насыщенность перифокальной зоны VEGF-R2 оказалась максимальной, повысившись в 20,9 раза по сравнению с контрольной группой и в 7,8 раза по сравнению с показателями во вторую неделю.

Была исследована неповрежденная кожа у мышей с перевивной меланомой В16/F10 на всех сроках эксперимента. Уже на первую неделю эксперимента в коже снизился уровень эстрадиола в 1,6 раза, общего тестостерона – в 1,9 раза и свободной формы Т – в 27,1 раза. При этом насыщенность неповрежденной кожи VEGF-A повысилась в 1,4 раза, VEGF-C – в 3,5 раза, VEGF-R1 – в 2 раза, а VEGF-R2 – в 1,7 раза. На вторую неделю эксперимента в коже продолжилось снижение эстрогенов и андрогенов – за счет снижения эстрона в 1,8 раза, эстрадиола в 1,6 раза, общего тестостерона в 2 раза и свободной формы в 35,6 раза. Насыщенность кожи факторами роста и их рецепторами во вторую неделю роста меланомы практически не отличалась от первой: уровень VEGF-A превышал показатели контрольной группы в 1,3 раза, VEGF-C – в 3 раза, VEGF-R1 – в 2 раза, VEGF-R2  в 1,4 раза. В третью неделю роста меланомы в неповрежденной коже уровень эстрона превысил норму в 1,3 раза, на фоне сниженного в 1,8 раза эстриола, в 3 раза Т и в 89 раз св Т. При этом насыщенность кожи VEGF-A оставалась повышенная в 1,7 раза, а VEGF-C – в 8,5 раза по сравнению с контролем и в 2,8 раза по сравнению с показателями во вторую неделю эксперимента. Уровень VEGF-R1 в коже превышал норму в 1,9 раза, а VEGF-R2 – возрос в 2,9 раза по сравнению с предыдущим этапом роста и в 4 раза по сравнению с контролем.

Анализируя полученные результаты, можно сказать, что в процессе роста меланомы В16/F10 в опухоли превалирующим эстрогеном оказался эстрон, повышение уровня которого происходит на фоне снижения концентрации эстрадиол и эстриола (неактивного метаболита эстрогенов), а также андрогенов (предшественников в цепи синтеза). Скорее всего, это связано с изменением субстратной специфичности и/или активности ферментов синтеза и метаболизма стероидов, однако это требует дальнейшего исследования. Несмотря на то что в начале эксперимента (1-я и 2-я недели) в окружающих опухоль перифокальной зоне и неповрежденной коже уровень эстрона даже снизился, к концу эксперимента его количество превысило показатели контрольной группы. Возможно, клетки опухоли являлись «ловушкой» необходимых для собственного роста гормонов и факторов роста, оттягивая необходимые вещества из близлежащих регионов. Для подтверждения этого предположения мы рассчитали среднее содержание эстрона в опухоли и окружающих ее тканях на разных этапах роста меланомы. В результате подтвердили, что в 1-ю и во 2-ю недели средняя концентрация эстрона в опухоли и окружающих ее тканях не превышала показатели в контрольной группе, концентрируясь в меланоме, а к 3-й повысилась в 1,7 раза. К концу эксперимента, когда меланома оказалась достаточно насыщена эстроном, его уровень повысился и в окружающих тканях.  В процессе роста меланомы перифокальная зона и неповрежденная кожа оказываются опухолевым полем, подчиненным ее метаболической «программе», а конкретно инверсии синтеза стероидов в пользу эстрона. На протяжении всего эксперимента в ткани опухоли существенно вырос уровень как VEGF-A и VEGF-C, так и их рецепторов. Причем для опухоли был более выражен прирост VEGF-A и его рецептора, чем VEGF-C и VEGF-R2. В окружающих опухоль тканях установлен значительный рост VEGF А и С и их рецепторов к 3-й недели эксперимента, к тому моменту, когда в этих тканях произошло накопление эстрона. S. Hyder с соавторами продемонстрировали, что в составе гена VEGF находятся две последовательности, гомологичные эстроген-чувствительным элементам и специфически связывающие обе формы рецепторов эстрогенов – α и β [8]. Ранее нами было установлено изменение гормонального статуса и повышение уровня VEGF и VEGF-R в пигментных новообразованиях кожи у людей [5; 6].  Для перифокальной зоны приоритетным оказалось повышение уровня VEGF-A, а для неповрежденной кожи – VEGF-C. Считают, что ключевым регулятором роста кровеносных сосудов является VEGF-A, тогда как VEGF-C регулирует преимущественно лимфоангиогенез [1]. Очевидно, повышение насыщенности тканей эстроном оказало стимулирующее действие на усиленную экспрессию факторов роста и их рецепторов. Таким образом, одним из патогенетических моментов роста перевивной меланомы В16 явилась аутокринная регуляция с помощью измененного стероидогенеза, экспрессии VEGF и их рецепторов, затем по мере роста переросшая в парокринное действие на окружающие ткани. В результате чего произошло расширение опухолевого поля с преобразованием гормонального фона и насыщенности факторами неоангио- и неолимфогенеза перифокальной зоны и неповрежденной кожи.

Непомнящая Е.М., д.м.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории иммунофенотипирования опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» М3 РФ, г. Ростов-на-Дону;

Шихлярова А.И., д.б.н., профессор, зав. лабораторией изыскания новых противоопухолевых средств ФГБУ «Ростовский-на-Дону научно- исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону.