На наш взгляд, наиболее перспективным методом для стандартизации сырья и препаратов расторопши пятнистой с учетом вариабельности химического состава данного растения является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которая одновременно может сочетать качественное и количественное определение флаволигнанов.
Цель данной работы – исследование по разработке методики количественного определения суммы флаволигнанов в гепатопротекторном лекарственном средстве «Силимар» с использованием ВЭЖХ.
Материал и методы исследования
Анализ лекарственного средства «Силимар» (субстанция), производство которого осуществляется в условиях ЗАО «Самаралектравы» (п. Антоновка, Самарская обл.), проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «Biotronic» с УФ-детектором с использованием хроматографической колонки «Phenomenex Luna C18(2)» (250х2,0 мм) и элюентной системы (мобильная фаза), представляющей собой смесь ацетонитрила и буферного раствора, подкисленного Н3РО4 до рН 3,0, в соотношении 30:70 (изократический режим) при аналитической длине волны 288 нм.
УФ-спектры растворов лекарственного средства «Силимар» и ГСО силибина (ФС 42-0072-01) определяли на спектрофотометре «Speсord 40» (Аnalytik Jena).
Результаты исследования и их обсуждение
Определено, что максимум поглощения в УФ-спектрах растворов ГСО силибина (рис. 1) и лекарственного препарата «Силимар» (рис. 2) находится при длине волны 288 нм, что свидетельствует о целесообразности проведении анализа при данной аналитической длине волны. На хроматограмме испытуемого раствора (рис. 3) пики 1, 2 и 3 принадлежат флаволигнанам силикристину, силибину и силидианину, имеющим время удерживания 9.158 мин, 18.74 мин и 22.57 мин соответственно. Время удерживания пика ГСО силибина составляет 18.91 мин (рис. 4), что подтверждает объективность идентификации данного вещества на хроматограмме испытуемого раствора. Дополнительным доказательством идентификации силибина является введение внутренней пробы ГСО силибина в испытуемый раствор, что приводит к увеличению интенсивности пика 2 (рис. 5). Установлено также, что силикристин и силидианин имеют хорошо воспроизводимые значения относительных времен удерживания по отношению к ГСО силибину 0,5 и 1,2 соответственно, что можно успешно использовать в анализе препарата. «Силимар».
Рис. 1. УФ-спектр раствора ГСО силибина
Рис. 2. УФ-спектр раствора лекарственного препарата «Силимар»
Рис. 3. Хроматографический профиль раствора препарата «Силимар»
Рис. 4. Хроматографический профиль раствора ГСО силибина
Рис. 5. Хроматографический профиль раствора препарата «Силимар» с внутренним стандартом ГСО силибина
Методика количественного определения. Около 0,05 г (точная навеска) лекарственного препарата (субстанция «Силимар») помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 25 мл спирта 95 % и растворяют при температуре от 60 0С до 70 0С на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы объем раствора доводят спиртом 95 % до метки и перемешивают (испытуемый раствор). 20 мкл испытуемого раствора вводят в жидкостный хроматограф «Biotronic» и анализ осуществляют методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в изократическом режиме с использованием хроматографической колонки «Phenomenex Luna C18(2)» (250х2,0 мм) и элюентной системы (мобильная фаза), представляющей собой смесь ацетонитрила и буферного раствора, подкисленного Н3РО4 до рН 3,0, в соотношении 30:70, при аналитической длине волны 288 нм (скорость элюирования – 0,4 мл/мин).
Анализ осуществляют в трех повторностях. По 3 параллельным определениям рассчитывают среднюю площадь пика силибина, а также площадь пиков силикристина и силидианина, имеющих относительное время удерживания по отношению к ГСО силибину 0,5 и 1,2 соответственно.
Параллельно осуществляют анализ раствора А ГСО силибина при длине волны 288 нм в тех же условиях.
Содержание суммы флаволигнанов в силимаре в процентах (Х) в пересчете на силибин вычисляют по формуле:
,
где:
S – Сумма значений площадей пиков силибина и двух доминирующих флаволигнанов испытуемого раствора с относительными временами удерживания по отношению к ГСО силибину 0,5 (силикристин) и 1,2 (силидианин) на хроматограмме испытуемого раствора;
Sо– площадь пика силибиина на хроматограмме стандартного образца;
m – навеска препарата, г;
mо – масса силибина в растворе ГСО, г;
Определено, что содержание суммы флаволигнанов в образцах лекарственного препарата «Силимар» варьирует 71,57 % +2,37 %. до 78,43 % +3,05 % (в пересчете на государственный стандартный образец силибина). Следовательно, в качестве нижнего предела можно рекомендовать показатель «не менее 65,0 %», как это и было предусмотрено в нормативной документации.
Ошибка единичного определения методики с доверительной вероятностью 95 % составляет +4,85 %.
Примечания: 1. Приготовление раствора ГСО силибина (ФС 42-0072-01). Около 0,02 г (точная навеска) ГСО силибина растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 80 мл 95 % спирта при нагревании на водяной бане при температуре от 70 до 80 0С. Раствор охлаждают, доводят объем раствора до метки 95 % спиртом и перемешивают (раствор А). Срок годности раствора 1 месяц.
. Объем вводимой пробы составляет 20 мкл.
2. Приготовление элюента для ВЭЖХ.
Навеску калия гидрофосфата (ЧДА ГОСТ 2493-75) 1,36 г переносят в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в воде и разбавляют водой до метки, перемешивают. Полученный раствор подкисляют раствором ортофосфорной кислоты до рН 3.00±0.01. Раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0.4–0.5 мкм. Раствор дегазируют с помощью ультразвуковой ванны непосредственно перед анализом. Раствор годен в течение 1 месяца.
3. Проверка пригодности хроматографической системы. Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия: эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику силибина, должна быть не менее 3000 теоретических тарелок.
Выводы
1. Разработана методика количественного определения суммы флаволигнанов в лекарственном препарате «Силимар» методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием хроматографической колонки «Phenomenex Luna C18(2)» (250х2,0 мм) и элюентной системы, представляющей собой смесь ацетонитрила и буферного раствора, подкисленного Н3РО4 до рН 3,0, в соотношении 30:70 (изократический режим) при аналитической длине волны 288 нм.
2. Определено, что содержание суммы флаволигнанов в образцах лекарственного препарата «Силимар» варьирует от 71,57 % +2,37 % до 78,43 % +3,05 % (в пересчете на государственный стандартный образец силибина). Ошибка единичного определения методики с доверительной вероятностью 95 % составляет +4,85 %.
Рецензенты:Первушкин С.В., д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой фармацевтической технологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Самара;
Правдивцева О.Е., д.фарм.н., доцент кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Самара.