Традиционными объектами изучения процессов липопероксидации при различных формах нарушения кровообращения были и остаются сердце и головной мозг. Вместе с тем имеются органы и ткани, в частности почки, которые не менее уязвимы для повреждающих факторов ишемии и реперфузии [8], а нарушение их функций лежит в основе вторичных нарушений кровообращения, водно-солевого обмена и интоксикации организма [7]. Увеличение образования продуктов липопероксидации, а также уменьшение активности антиоксидантных систем в почках установлено в экспериментах с использованием различных моделей гипоксии-реоксигенации, ишемии-реперфузии [3]. Состояние системы свободнорадикального окисления (СРО) является универсальным неспецифическим критерием патологических процессов и представляет собой процесс непосредственного переноса кислорода на субстрат с образованием перекисей, кетонов, альдегидов, причем характерной чертой является его цепной самоиндуцирующийся характер [9].
Механизмы, определяющие особенности липопероксидации при ишемическом повреждении почек, вызванном остановкой системного кровообращения, и реперфузии, требуют дальнейшего изучения.
Целью настоящего раздела работы явилось изучение влияния новокаиновой паранефральной блокады на уровень образования продуктов ПОЛ в корковом веществе почек крыс разного возраста и пола в динамике острой ишемии-реперфузии.
Материалы и методы
В работе использованы 60 белых беспородных крыс обоего пола массой 200-250 г (молодые животные) и 300-350 г (старые животные). Исследование проводилось на модели «две почки, один зажим». Наркотизированные животные размещались в положении «на спине». Шерсть на животе удаляли, операционное поле обрабатывали 70°-ным этиловым спиртом. Разрез проводили вдоль белой линии живота от мечевидного отростка грудины до лобка, рассекали кожу и соединительную ткань. Выделяли сосудистую ножку правой почки, которую затем клипировали зажимом Холстеда на 20 мин. Рану на протяжении периода ишемии прикрывали салфеткой, смоченной стерильным физраствором. Через 20 мин зажим с почечной ножки снимали, тем самым восстанавливали кровоснабжение ишемизированной почки (реперфузия), операционную рану ушивали послойно. Через определенные промежутки времени от момента реперфузии (1 ч, 3 ч, 48 ч) крыс умерщвляли декапитацией на гильотине. Для исследования забирали правую (ишемизированную) и контралатеральную почки, выделяли корковый слой; 100 мг ткани промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), гомогенизировали в 1 мл 1х PBS и оставляли на ночь при -20°C. Для полного разрушения клеточных мембран проводили два цикла замораживания-оттаивания. Полученную суспензию центрифугировали 5 мин при 5000 g (2-8°C). Супернатант отбирали, делили на аликвоты и хранили при -20°C или -80°C. Перед измерением размороженные образцы центрифугировали.
Блокаду паранефральной клетчатки осуществляли путем введения 0,1 мл 2%-ного раствора новокаина непосредственно перед проведением процедуры ишемии и повторно перед реперфузией. В гомогенатах тканей коркового слоя левой и правой почек были изучены уровни содержания малонового диальдегида [4] и диеновых конъюгатов [2].
Статистическая обработка материала проводилась с помощью программы Statistica 6,0 c определением средних значений с указанием стандартных отклонений. Значимость различий средних показателей оценивалась с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона. Существенными считали различия при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Первичными продуктами ПОЛ являются диеновые конъюгаты, которые относятся к токсическим метаболитам, оказывающим повреждающее действие на липопротеиды, белки, ферменты и нуклеиновые кислоты [6]. В исследовании Симион А.Ю. и соавт. [5] показана интенсификация перекисного окисления липидов при ишемическом повреждении тканей печени, сердца и головного мозга, что может быть причиной дезинтеграции биологических мембран в условиях гипоксии. А наиболее высокий уровень первичных продуктов ПОЛ, который был выявлен в кардиомиоцитах, по мнению авторов, свидетельствует о высокой чувствительности ткани сердечной мышцы к гипоксии.
В нашем исследовании при ишемии-реперфузии почки в зависимости от пола и возраста лабораторных животных не получено подтверждения этому постулату. Напротив, в корковом веществе правой и левой почек интактных молодых самок и старых самцов, оказавшихся самыми устойчивыми к повреждающему действию указанных факторов, уровень диеновых конъюгатов (ДК) оказался в 2 и более раз выше, чем в аналогичных тканях старых самок и молодых самцов как наиболее чувствительных к патологическому действию ишемии-реперфузии (табл. 1).
Таблица 1
Влияние новокаиновой блокады на содержание диеновых конъюгатов (мкМ\г тк) в корковом веществе почки, подвергнутой ишемии-реперфузии, и контралатеральной почки крыс разного пола и возраста
|
Группы крыс |
Старые самки |
Молодые самки |
Старые самцы |
Молодые самцы |
||||
|
почка |
правая |
левая |
правая |
левая |
правая |
левая |
правая |
левая |
|
интактн |
7,9± 0,6 |
5,5± 0,4 |
15,8± 1,3 |
14,6± 1,1 |
14,1± 0,8 |
12,3± 1,3 |
6,2± 0,7 |
6,6± 0,6 |
|
1 ч |
12,7± 1,11 |
3,2± 0,31 |
3,3± 0,41 |
5,9± 0,61 |
7,2± 0,81 |
7,3± 0,61 |
9,2± 0,71 |
2,2± 0,31 |
|
1 ч + блокада |
22,5± 1,31,2 |
22,2± 1,81,2 |
- |
- |
22,5± 1,61,2 |
21,0± 1,41,2 |
- |
- |
|
3 ч |
5,5± 0,51 |
7,9± 0,81 |
3,2± 0,51 |
5,7± 0,61 |
7,8± 0,91 |
7,6± 0,81 |
16,9± 1,51 |
9,1± 0,71 |
|
48 ч |
5,7± 0,61 |
14,2± 1,11 |
3,8± 0,41 |
5,4± 0,41 |
7,4± 0,71 |
7,7± 0,51 |
5,7± 0,6 |
14,1± 1,21 |
|
48 ч + блокада |
19,3± 1,71,2 |
18,8± 1,61,2 |
- |
- |
21,8± 1,91,2 |
21,0± 1,31,2 |
- |
- |
Примечание: 1 - достоверно по отношению к показателю в интактной ткани;
2 - достоверно по отношению к показателю без блокады
В динамике восстановления кровотока содержание первичных продуктов ПОЛ в корковом веществе почки, подвергнутой процедуре ишемии-реперфузии, и контралатеральной почки было специфическим. Так, у молодых самок и старых самцов в сроки 1 ч, 3 ч и 48 ч после восстановления кровотока уровень ДК снизился: в корковом веществе правой почки у самок - в среднем в 4,6 раза, у самцов - в 1,9 раза; левой почки у самок - в среднем в 2,6 раза, у самцов - в 1,6 раза.
Иная динамика отмечена в корковом веществе почек старых самок и молодых самцов. Через 1 ч после восстановления кровотока в корковом веществе правой и левой почек найдены разнонаправленные изменения содержания ДК: в правой - увеличение в 1,6 раза и 1,5 раза у самок и самцов соответственно; в левой - падение в 1,7 раза и 3 раза соответственно. Через 3 ч и 48 ч после восстановления кровотока снова отмечены разнонаправленные колебания уровня ДК в правой и в левой контралатеральной почках старых самок и молодых самцов (табл. 1).
Активация процессов ПОЛ формирует цепи окисления с участием первичных (диеновые конъюгаты), промежуточных и конечных продуктов пероксидации. Эти приводит к изменению проницаемости плазматических мембран, активности ферментов, изменяются свойства мембранных белков. По выраженности процессов ПОЛ можно судить о степени повреждения клеток.
Колебания уровня первичных продуктов ПОЛ сопровождались стойким накоплением одного из конечных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в динамике восстановления кровотока в органах всех групп животных. Вместе с тем в срок 48 ч после реперфузии уровень МДА в корковом веществе почки, подвергнутой ишемии-реперфузии, и контралатеральной почки молодых самок и старых самцов был значимо ниже, чем в органах старых самок и молодых самцов (табл. 2).
Таблица 2
Влияние новокаиновой блокады на содержание малонового диальдегида (нМ/г тк) в корковом веществе почки, подвергнутой ишемии-реперфузии, и контралатеральной почки крыс разного пола и возраста
|
Группы крыс |
Старые самки |
Молодые самки |
Старые самцы |
Молодые самцы |
||||
|
почка |
правая |
левая |
правая |
левая |
правая |
левая |
правая |
левая |
|
интактн |
6,2± 0,7 |
10,1± 0,9 |
11,9± 1,3 |
10,0± 0,8 |
11,0± 1,2 |
10,6± 1,1 |
9,0± 0,7 |
10,9± 1,1 |
|
1 ч |
57,7± 5,31 |
35,2± 4,11 |
18,0± 1,61 |
32,4± 2,41 |
39,9± 3,71 |
49,7± 5,01 |
17,1± 1,61 |
26,7± 2,21 |
|
1 ч + блокада |
34,1± 3,11,2 |
21,3± 1,81,2 |
- |
- |
23,2± 1,61,2 |
19,7± 1,41,2 |
- |
- |
|
3 ч |
48,2± 4,31 |
48,2± 4,71 |
35,2± 3,11 |
29,1± 2,71 |
57,1± 5,41 |
50,2± 4,61 |
58,7± 6,21 |
30,2± 2,91 |
|
48 ч |
47,1± 5,21 |
48,3± 4,61 |
32,2± 2,91 |
36,2± 3,41 |
31,9± 3,31 |
37,5± 3,81 |
50,4± 4,61 |
46,0± 4,31 |
|
48 ч + блокада |
33,0± 3,11,2 |
36,6± 3,51,2 |
- |
- |
23,6± 2,51,2 |
19,4± 1,71,2 |
- |
- |
Примечание: 1 - достоверно по отношению к показателю в интактной ткани;
2 - достоверно по отношению к показателю без блокады.
Далее мы изучили влияние новокаиновой паранефральной блокады почки на образование первичных и одного из вторичных продуктов ПОЛ - МДА в корковом веществе почки, подвергнутой ишемии-реперфузии, и контралатеральной почки старых самок (неустойчивые) и старых самцов (устойчивые). Результаты отражены в таблицах 1 и 2. Оказалось, что проведение новокаиновой блокады приводило к стойкому одинаковому повышению уровня ДК в обеих почках в динамике восстановления кровотока. Так, через 1 ч содержание первичного продукта ПОЛ в корковом веществе почек животных обеих групп составило в среднем 22,1 мкМ/г тк, через 48 ч - 20,2 мкМ/г тк. Показатели не имели достоверных различий ни между животными разного пола, ни между опытной и контралатеральной почками, ни по времени восстановления кровотока.
Проведение новокаиновой блокады приводило к снижению уровня МДА. Так, через 1 ч в корковом веществе старых самок снижение составило в среднем 1,7 раза в правой и левой почках относительно показателей без блокады. В этот срок исследования в корковом веществе почек самцов снижение уровня МДА составило 1,7 раза и 2,5 раза соответственно в правой и контралатеральной левой почке.
Через 48 ч от момента восстановления кровотока в корковом веществе почек старых самок уровень МДА снизился в среднем в 1,4 раза относительно аналогичного срока без блокады. Для самцов такое снижение составило 1,4 раза и 1,9 раза в правой и левой почках соответственно.
Очевидно, что проведение новокаиновой блокады структур, иннервирующих почки животных, вызывало повышение уровня первичных продуктов ПОЛ при одновременном снижении вторичных продуктов.
Учитывая такие колебания уровня ДК и МДА в корковом веществе почек между группами животных, устойчивых и неустойчивых к воздействию ишемии-реперфузии, мы сочли целесообразным рассчитать эффективность образования вторичных продуктов ПОЛ по коэффициенту ДК/МДА (табл. 3).
Таблица 3
Влияние новокаиновой блокады на эффективность образования вторичных продуктов ПОЛ (ДК/МДА) в корковом веществе почки, подвергнутой ишемии-реперфузии, и контралатеральной почки крыс разного пола
|
Группы крыс |
Старые самки |
Старые самцы |
||
|
почка |
правая |
левая |
правая |
левая |
|
интактн |
1274,2±132,8 |
544,6±53,1 |
1281,8±116,5 |
1160,4±120,4 |
|
1 ч |
220,1±18,31 |
90,9±8,41 |
180,5±16,91 |
167,0±14,21 |
|
1 ч + блокада |
659,8±53,31,2 |
606,6±48,92 |
969,8±85,31,2 |
1066,0±94,62 |
|
48 ч |
121,0±9,41 |
243,6±23,11 |
231,9±18,41 |
205,3±18,61 |
|
48 ч + блокада |
584,8±53,61,2 |
513,7±46,12 |
923,7±94,51,2 |
1185,6±87,52 |
Примечание: 1- достоверно по отношению к показателю в интактной ткани;
2 - достоверно по отношению к показателю без блокады.
Установлено, что в динамике ишемии-реперфузии повышалась интенсивность перехода первичных продуктов ПОЛ во вторичные продукты, в данном случае - МДА. Так, через 1 ч после восстановления кровотока в корковом веществе правой ишемизированной почки показатель ДК/МДА снижался у старых самок в 5,8 раза, а у старых самцов - в 7,1 раза. В корковом веществе левой почки снижение составило 6 раз и 7 раз соответственно относительно показателя у интактных животных соответствующего пола и возраста. Через 48 ч в корковом веществе правой ишемизированной почки показатель ДК/МДА снижался у старых самок в 1,8 раза относительно предыдущего срока исследования и в 10,5 раз относительно показателя у интактных животных соответствующего пола и возраста, а в левой контралатеральной почке показатель, напротив, увеличился в 2,7 раза, но оставался в 2,2 раза ниже контрольных величин. В корковом веществе правой почки старых самцов в этот срок исследования коэффициент ДК/МДА увеличивался в 1,3 раза относительно предыдущего срока исследования, но оставался в 5,5 раза ниже относительно показателя у интактных животных соответствующего пола и возраста.
Предварительное проведение новокаиновой блокады паранефральной клетчатки проводило к нормализации коэффициента ДК/МДА в корковом веществе левой контралатеральной почки обеих групп животных во все исследуемые сроки. В правой почке старых самок новокаиновая блокада вызывала увеличение показателя относительно значений у животных без блокады: через 1 ч после восстановления кровотока - в 3 раза, через 48 ч - в 4,8 раза, но оно оставалось ниже показателя у интакных животных в 2,2 раза. В правой почке старых самцов новокаиновая блокада вызывала увеличение показателя относительно значений у животных без блокады: через 1 ч после восстановления кровотока - в 5,4 раза, через 48 ч - в 4 раза, оставаясь при этом ниже показателя у интакных животных лишь в 1,4 раза.
Анализируя полученные результаты, следует отметить, что, с одной стороны, в исследовании подтвержден факт влияния ишемии-реперфузии на накопление продуктов свободнорадикального окисления, с другой - не совсем понятно синхронное изменение содержания ДК и МДА в контралатеральной почке. Нет ясности в том, отражает ли это изменение активацию ПОЛ в ткани почки, как подвергнутой ишемии-реперфузии, так и контралатеральной, либо другой конкретный ферментативный, генетически обусловленный процесс синтеза эйкозаноидов - большого семейства высокоактивных соединений, обладающих необычайно широким спектром биологических эффектов. Арахидоновая кислота является наиболее широко распространенным и, вероятно, самым важным предшественником эйкозаноидов. Известно, что образующиеся в процессе ее окисления гидроперекиси и циклические перекиси не могут накапливаться в организме, они разлагаются до жирных альдегидов, например малонового. Арахидоновая кислота образует 3 молекулы малонового диальдегида. Продукты расщепления кислоты подвергаются дальнейшему окислению с образованием малоновой кислоты, простагландинов, в дальнейшем из ПГН2 в отдельных метаболических путях образуются другие простагландины, тромбоксан и простациклин.
Нормализация эффективности образования МДА в обеих почках, т.е. подвергнутой ишемии-реперфузии и контралатеральной, под действием блокады паранефральной клетчатки новокаином, не обладающим антиоксидантными свойствами, также не совсем понятна и требует дальнейших исследований.
Рецензенты:
Геворкян Ю.А., д.м.н., профессор, отделения «ОАО-2» ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;
Ушакова Н.Д., д.м.н., профессор, врач анестезиолог-реаниматолог ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону.