Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Для создания матриц, применяемых в тканевой инженерии, используется обширный спектр материалов, имеющих природное и искусственное происхождение, а также их комбинации, позволяющие моделировать механические свойства скаффолдов и параметры биодеградации [5]. Одним из полимеров, применяемых для создания скаффолдов, является поликапролактон (ПКЛ), который не обладает цитотоксическими эффектами и способен к биодеградации в организме [2, 9]. Включенный в состав матрицы на основе ПКЛ гидроксиапатит (ГА), являющийся кристаллохимическим аналогом минеральной составляющей костной ткани и обладающий остеокондуктивностью, может найти широкое применение в клинической практике [2, 4]. Ранее проведенные исследования ПКЛ-скаффолдов в условиях in vitroпродемонстрировали хорошую адгезию и пролиферацию клеток, культивируемых на подобных матрицах [6, 8]. Основными требованиями, предъявляемыми к скаффолдам, являются их биосовместимость и способность, заселяясь клеточными элементами, со временем замещаться на собственные ткани организма [4].

Межгосударственный стандарт для изделий медицинского назначения ISO (ГОСТ 10993-1-2011) рекомендует для выявления местного патогенного действия материалов на живую ткань обязательное применение имплантационных тестов, в том числе и субкутанных. Известно, что система микроциркуляции динамически изменяется при сдвигах гомеостаза [1, 3], отражая функциональное состояние ткани. Поэтому для оценки местной воспалительной реакции на имплантацию различных скаффолдов, помимо обязательного морфологического анализа биоптатов зоны имплантации [7], перспективным, на наш взгляд, является использование параметров тканевой перфузии.

В связи с этим целью работы являлся сравнительный анализ воспалительных изменений микроциркуляции и динамики заселения клетками оригинальных скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА в условиях in vivo.

Материалы и методы

Экспериментальная работа была проведена в соответствии с Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным. За 5 мин до проведения манипуляций крысам вводили внутримышечно комбинацию ксилазина (Interchemie, Нидерланды) в дозе 1 мг/кг и золетила (Virbac Sante Animale, Франция) в дозе 0,1 мл/кг для достижения наркоза.

Оригинальные отечественные скаффолды на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА были разработаны и изготовлены лабораторией «Материалы специального назначения» Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского.

Эксперимент проведен на 60 белых нелинейных крысах самцах, разделенных на 2 экспериментальные группы: первой группе крыс имплантировали оригинальный скаффолд на основе ПКЛ (100%), а второй группе животных - скаффолд на основе ПКЛ (95%) и ГА (5%). Имплантация матриц была проведена по методике, аналогичной B Dorj et al. [10]. Скаффолд в форме диска диаметром 15 мм, толщиной 0,1 мм имплантировали подкожно в межлопаточную область животного. Крыс выводили из эксперимента путем декапитации на 7, 14 и 21 сутки по 10 особей из каждой группы.

Для морфологического сравнительного анализа оригинальных скаффолдов проводили забор мягких тканей зоны имплантации, совместно с матрицей, единым блоком. Материал для морфологического исследования фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина (ООО «Биовитрум», Россия), обезвоживали в спиртах восходящей крепости, после чего заливали в парафин. Срезы толщиной 5-10 мкм окрашивали гематоксилином Майера (ООО «Биовитрум», Россия) и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Для покрытия срезов применяли Bio-Monht и Bio-Clear («Bio Optica», Италия). С помощью микроскопа AxioImager Z2 (производство CarlZeiss, Германия) оценивали и сравнивали между собой структуру, клеточный состав, состояние микроциркуляторного русла окружающих матрицы мягких тканей, динамику заселения скаффолдов клеточными элементами и состав клеточных популяций матриц.

Микроциркуляцию оценивали методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ). Проводилось определение, а затем сравнительный анализ показателей перфузии в перфузионных единицах, а также нормированных амплитуд нейрогенных, миогенных и эндотелиальных осцилляций микрокровотока с помощью спектрального вейвлет-анализа. Регистрацию ЛДФ-грамм осуществляли на 7, 14 и 21 день эксперимента над областью имплантации матриц. Для контроля использовали ЛДФ-граммы, зарегистрированные у крыс до имплантации.

Статистическую обработку данных осуществляли средствами программы Statistica 10. Большинство полученных данных не соответствовали закону нормального распределения, поэтому для сравнения показателей использовали U-критерий Мана-Уитни. Значимыми считали различия при p <0,05.

Результаты

В результате проведенного исследования установлено, что на 7-е сутки эксперимента показатель перфузии кожи статистически значимо выше над областью имплантации скаффолда на основе ПКЛ, чем матрицы на основе ПКЛ и ГА (табл. 1). На 7 сутки после имплантации матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА изменения нормированных амплитуд колебаний в эндотелиальном, нейрогенном и миогенном диапазонах не имеют статистически значимых различий между собой (табл. 2), а также по сравнению с контролем (p>0,005).

В ходе сравнения морфологической картины установлено, что через 7 суток после имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА воспалительные изменения проявляются полнокровием сосудов микроциркуляторного русла, умеренным отеком подкожной клетчатки, а также инфильтрацией ее единичными лейкоцитами как в одной, так и в другой группах животных. При этом в обеих экспериментальных группах заселение скаффолда элементами соединительной ткани наиболее ярко выражено на границах матриц с тканями.

Таблица 1

Изменения перфузии кожи у животных при подкожной имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА

Примечания: В каждом случае приведены медиана, верхний и нижний квартили (25%; 75%), p - показатель достоверности по отношению к данным, полученным при имплантации ПКЛ-скаффолдов.

Таблица 2

Сравнительная характеристика колебаний микрокровотока кожи при подкожной имплантации матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА

Примечания: те же, что и в табл.1.

В структуре обеих сравниваемых матриц через 7 суток после имплантации присутствуют единичные лейкоциты на фоне преобладающих фибробластических элементов. Статистически значимых различий количества нейтрофильных лейкоцитов, моноцитов и макрофагов, а также лимфоцитов между группами не выявлено (табл. 3).

Таблица 3

Динамика состава клеточных популяций при подкожной имплантации матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА (число клеток на одно поле при увеличении х400)

Примечания: те же, что и в табл. 1.

Таким образом, данные полученные в ходе морфологического исследования, соответствуют динамике показателей микроциркуляции и свидетельствуют об умеренной степени выраженности реактивных реакций в обеих группах животных.

На 14-е сутки после имплантации скаффолдов не выявлено статистически значимых различий перфузионного показателя при сравнении опытных групп животных между собой (табл. 1). Нормированные амплитуды эндотелиальных, миогенных и нейрогенных колебаний у животных сравнимых групп также не имеют значимых различий спустя 14 суток после имплантации (табл. 2).

При сравнении морфологической картины мягких тканей зоны имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА на 14-е сутки эксперимента обнаружено, что у животных данных групп сохраняются незначительные реактивные изменения, проявляющиеся полнокровием кровеносных сосудов, степень выраженности которого не зависит от вида используемой матрицы. При имплантации как скаффолда на основе ПКЛ, так и матрицы, содержащей ГА, лейкоцитарная инфильтрация перифокальной зоны представлена единичными нейтрофилами и лимфоцитами.

На 14-е сутки после имплантации увеличивается число фибробластических элементов в структуре матриц, а клеточные элементы равномерно распределяются по структуре имплантатов. При этом количество фиброцитов и фибробластов статистически значимо выше в структуре скаффолда на основе ПКЛ по сравнению со скаффолдом на основе ПКЛ и ГА (табл. 3). В составе клеточной популяции обеих изучаемых матриц на 14 сутки после имплантации присутствуют единичные лейкоциты: нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты, количество которых не имеет статистически значимых различий между группами (табл. 3). Оба типа матриц на 14-е сутки после имплантации содержат сосуды. Различий степени выраженности васкуляризации в зависимости от вида скаффолда не выявлено.

Таким образом, данные ЛДФ-грамм при имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА через 14 дней не имеют статистически значимых различий, но заселение матрицы на основе ПКЛ клетками фибропластического ряда на 14-е сутки исследования протекает интенсивнее по сравнению со скаффолдом на основе ПКЛ и ГА.

На 21-е сутки перфузионный показатель и нормированные амплитуды нейрогенных и миогенных колебаний микрокровотока кожи у животных с имплантацией изучаемых типов скаффолдов не имеют статистически значимых различий (табл. 1, 2). При этом нормированные амплитуды эндотелиальных колебаний при имплантации матрицы на основе ПКЛ и ГА статистически значимо превышают таковые в группе животных, которым проводилась имплантация ПКЛ-скаффолда (табл. 2). Однако, значения нормированных амплитуд эндотелиальных колебаний в группах животных, которым проводилась имплантация матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА, на 21-е сутки эксперимента находятся в пределах вариабельности до имплантационных значений (р=0,561276 и р=0,183098 соответственно).

На 21 день реактивные изменения тканей перифокальной зоны не выявлены. При использовании как одного, так и другого вида матриц, отмечается умеренное кровенаполнение сосудов перифокальной зоны. Изучаемые матрицы равномерно заселены клетками фибробластического ряда и васкуляризованы. Однако, количество фиброцитов в ПКЛ-скаффолдах статистически значимо выше, чем в матрицах на основе ПКЛ с ГА, что отражает различную интенсивность их заселения (табл. 3).

В составе клеточных популяций матриц на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА на 21 сутки после имплантации присутствуют единичные лейкоциты: нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты, количество которых не имеет статистически значимых различий между группами (табл. 3). На 21-е сутки после имплантации происходит истончение волокон в обеих изучаемых матрицах, что свидетельствует о начавшейся биодеградации.

Таким образом, при имплантации скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА изменения микроциркуляции кожи слабо выражены в обеих группах и не имеют между собой значимых отличий, наиболее ярко проявляясь на 7-е сутки и полностью исчезая на 21-е. Изменения показателей ЛДФ-грамм полностью соответствуют динамике морфологической картины, свидетельствующей о том, что наибольшие реактивные изменения окружающих тканей отмечаются на 7-е сутки и полностью купируются к 21-м суткам как при имплантации ПКЛ-скаффолда, так и матрицы на основе ПКЛ с ГА.

Выводы

При сравнительном анализе скаффолдов на основе ПКЛ и ПКЛ с ГА установлено, что изменения микроциркуляции кожи слабо выражены в обеих группах и не имеют между собой значимых отличий. Изменения динамики перфузии кожи соответствуют динамике морфологической картины в обеих экспериментальных группах. Заселение ПКЛ-скаффолдов и скаффолдав на основе ПКЛ с ГА клетками соединительной ткани протекает активно в период с 7-х по 21 сутки эксперимента, но интенсивность заселения клеточными элементами выше при имплантации матрицы на основе ПКЛ. Установлено также, что спустя 21-е сутки с момента имплантации скаффолдов обоего типа появляются первые признаки их биодеградации

Таким образом, отечественные скаффолды как на основе ПКЛ (100%), так и ПКЛ (95%) с ГА (5%) способны к интеграции в соединительную ткань в условиях in vivo. Активное заселение исследуемых матриц соединительнотканными элементами, васкуляризация на фоне незначительных реактивных изменений при подкожной имплантации убедительно демонстрирует их биосовместимость. Однако при подкожной имплантации матриц на основе ПКЛ с ГА скорость их заселения соединительнотканными элементами меньше, чем при использовании ПКЛ-скаффолдов.

Рецензенты:

Киреев С.И., д.м.н., профессор кафедры травматологии и ортопедии, ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, г. Саратов;

Антипова О.Н., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии им. И.А. Чуевского, ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, г. Саратов.