На настоящий момент в области эндопротезирования отмечается тенденция в исследованиях, направленных на создание биоматериалов, способных заменить поврежденные участки тканей человеческого организма [1, 2, 4]. Наиболее успешно эти исследования проводятся при лечении патологии костно-мышечной системы, в том числе при эндопротезировании крупных суставов. На данный момент нержавеющая сталь и титановые сплавы являются основными материалами, которые используются для изготовления погружных имплантатов. Тем не менее применение фиксаторов из биоинертных металлов при остеосинтезе требует повторных оперативных вмешательств, направленных на удаление выполнивших свою роль металлических имплантатов, и нередко это является не менее травматичным процессом, чем сам остеосинтез. Поэтому остается актуальным вопрос о поиске биорезорбируемых материалов, пригодных для создания имплантатов, применяемых в остеосинтезе, которые могли бы полностью метаболизироваться организмом, не оказывая при этом патологического воздействия на окружающие ткани и организм в целом [2]. К подобным материалам относятся магниевые сплавы, которые благодаря прочностным характеристикам являются пригодными для изготовления различных типов имплантатов. Как биоинертные, так и биорезорбируемые материалы при их внедрении в организм контактируют с антигенпрезентирующими клетками и их свойства, такие как топография поверхности, химический состав, играют важную роль в инициации про- или противовоспалительного иммунного ответа.
Исходя из вышеизложенного, цель работы - выявить иммуномодулирущие свойства биоинертных (титановых) и биорезорбируемых (магниевых) металлических имплантатов по степени их влияния на экспрессию рецепторов на плазматической мембране ДК.
Материалы и методы
В работе использовался технически чистый титан коммерческой марки ВТ1-0 и сплав магния MA8 (1.5-2.5 wt. % Mn; 0.15-0.35 wt. % Ce; Mg - основа). Полученные образцы перед использованием стерилизовали в сухожаровом шкафу (Термо Фишер Сайнтифик, Финляндия) при 180 0С в течение 15 мин, что соответствовало правилам стерилизации медицинских изделий, при этом проводили контроль поверхностных свойств образцов.
Первичную культуру недифференцированных клеток миелоидного пула получали по методу M.В. Lutz с соавторами [7] из костного мозга бедренной кости морских свинок путем промывания костномозгового канала средой RPMI-1640 (Sigma, США). Костный мозг гомогенизировали на диссоциаторе (MilteniBiotec, Германия), трижды промывали средой с центрифугированием и переносили в обогащенную среду культивирования. Конечная концентрация клеток составила 8х106 в 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 0,1 мг/мл гентамицина-К (БиолоТ, Россия) и 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Биоло Т, Россия). Клеточную суспензию разносили во флаконы c лектиновым покрытием (контроль) и с образцами имплантатов, инкубировали в течение 3 ч в СО2-инкубаторе при 37 0С, после чего удаляли неадгезированные клетки. Затем для индукции созревания ДК в среду добавляли 80 нг/мл гранулоцит-моноцитарного колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и 20 нг/мл интерлейкина-4 (ИЛ-4, Sigma, США). На третьи сутки проводили повторную цитокиновую стимуляцию и продолжали инкубировать, проводя смену среды каждые трое суток. Качество культуры оценивалось методом прижизненного наблюдения клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии.
Непрямой метод флюоресцирующих антител (нМФА). Монослой клеток выдерживали во влажной камере в течение 30 мин в термостате при 37 0С, затем промывали рабочим буферным раствором с твином в течение 10 мин. Демаскировка неспецифического антигена проводилась путем инкубирования образцов в течение 1 ч в растворе 3 % сывороточного альбумина (Sigma, США) на основе рабочего буфера в объеме 5-10 мкл. Препараты выдерживали во влажной камере в течение 30 мин в термостате при 37 0С, потом промывали рабочим буферным раствором с твином в течение 10 мин. Затем на монослой клеток наносили моноклональные антитела против CD34,CD38, конъюгированные с фикоэритрином (PE), и против CD14,CD80, CD83, CD86, конъюгированные с флуоресцеином (FITC, Sigma, США). Препараты исследовали с помощью лазерной конфокальной микроскопии в системе LSM510META (CarlZeiss, Германия), при возбуждении 546 нм для PE и 486 нм для FITC подсчитывали 100 клеток, и выражали в проценте количество антигенположительных, а также определяли интенсивность свечения.
Результаты
О степени дифференцировки и зрелости ДК можно судить по изменению уровня экспрессии их дифференцировочных молекулярных кластеров CD34, CD38. Известно, что рецептор CD34 клеток гемопоэтического пула относится к лигандам межклеточной адгезии и играет важную роль на ранних этапах кроветворения. Так, появление CD34 на мембранах клеток опосредует их адгезию на внеклеточном матриксе путем связывания со специфичными гликанами, а через эти молекулы с лектинами. Клетки CD34+ фенотипа в нормальном костном мозге являются предшественниками как ДК, так и макрофагов с гранулоцитами, и такие клетки «промежуточного» типа на 6-е сутки культивирования под влиянием индуктора способны дифференцироваться в ДК либов лейкоциты. Для того чтобы изучить роль имплантатов в качестве индукторов созревания, проводили анализ рецепторного фенотипа ДК. Первичную культуру недифференцированных клеток миелоидного пула из костного мозга помещали во флаконы с образцами и культивировали в присутствии ГМКСФ и ИЛ-4. В качестве контроля использовали клетки, адгезированные к поверхности специализированного пластика, покрытого лектином, а для получения популяции зрелых ДК вносили липополисахарид Escherichiacoli (ЛПС). Известно, что культивирование ДК в присутствии ГМ-КСФ и ИЛ-4 с добавлением 2,5 нг/мл ЛПС стимулирует созревание ДК и снижает в культуре содержание макрофагов [6]. Определено, что максимальная экспрессия CD34 на поверхности ДК наблюдалась на 1-е сутки совместного инкубирования с ЛПС, и содержание клеток составило 72±5,8 %. В дальнейшем, их количество снижалось, достигая минимальных цифр к концу срока наблюдения (1,6±0,08 %). Под влиянием имплантатов количество CD34 положительных клеток, по сравнению с контролем, было ниже. Так, для образцов с титаном через 1 сутки показатель составил 56±4,8 %, а и для образцов с магнием 48±4,6 %. Минимальное количество указанных клеток отмечалось в конце срока наблюдения (21 с) и составило 1,8±0,2 % и 2,4±0,6 % соответственно. Таким образом, полученные нами данные указывают на одинаковое относительно друг друга влияние имплантатов на экспрессию рецептора адгезии, а сниженный, относительно контроля, процент содержания этих клеток на выраженное их действие как индукторов созревания клеток.
В качестве показателя, отражающего направление дифференцировки клеток гемопоэтического пула под влиянием имплантатов, определяли степень экспрессии мембранного гликозилфосфатидилинозитол-связанного белка CD14. Этот компонент является элементом рецепторного комплекса CD14/TLR4/MD2, распознающего липополисахарид, и экспрессируется на поверхности клеток миелоидного ряда, особенно на макрофагах. Нами обнаружено, что в контрольном образце при указанных выше условиях, минимальноеколичество клеток с высокой степенью экспрессии CD14 определялось на 9-е сутки (рис. 1а), тогда как содержание клеток, положительных по выявлению маркера терминальной дифференцировки ДК - CD83, в эти сроки наблюдения было максимальным. Показатели составили 14±1,8 % и 67±5,8 % соответственно. Эти данные указывают на то, что внесение ЛПС оказывает выраженное влияние на созревание именно популяции ДК. При изучении степени экспрессии указанных рецепторов в клеточных популяциях, контактировавших с имплантатами, выявлено, что наибольшим активирующим воздействием на дифференцировку в направлении ДК обладал магний (рис. 1б). Так, на 9-е сутки совместной инкубации с магнием содержание CD14+ клеток составило 26±2,8 % и CD83+ 58±4,6 %, тогда как при контакте с титаном 32±3,1 % и 48±3,6 %. В последующие сроки наблюдения количество CD14+ клеток находилось на указанном уровне, а при контакте с имплантатами незначительно снижалось. Приведенные данные указывают на выраженное влияние магниевого имплантата на направленность дифференцировки клеток гемопоэтического пула преимущественно в сторону ДК.
Интерес представляют полученные нами данные о степени экспрессии костимулирующих молекул CD80 и CD86 на поверхности ДК при их взаимодействии с имплантатами в зависимости от времени инкубирования. Эти рецепторы межклеточной адгезии взаимодействуют с соответствующим им лигандам с высокой авидностью, при условии их экпрессии на мембранах клеток кластерами. Несмотря на то, что в начальные сроки наблюдения ЛПС активировал созревание ДК в большей степени, чем имплантаты, с течением времени уровень экспрессии костимулирующих молекул на поверхности клеток под влиянием титана и магния повышался. Причем, при относительно невысоких показателях количества CD80 и CD86 положительных ДК, интенсивность их свечения возрастала (рис. 1) и экспрессия CD80 молекулы на ДК, инкубированных с имплантатами оставалась повышенной (23,8±2,6 % и 21,2±3,4 %, соответственно) по сравнению с ДК, обработанными ЛПС (0,6±0,2 %) до конца срока наблюдения.
Лейкоцитарный антиген CD38 является бифункциональным ферментом, сочетающим АДФ-рибозилциклазную и цАДФ-рибозил гидролазную активность, экспрессируется на кроветворных клетках, соответственно их степени дифференцировки или пролиферации. Продукт ферментативной активности CD38 - циклическая АДФ-рибоза является универсальным катализатором кальция из внутреннего депо. Причем, основная функция рецептора CD38 состоит в регуляции активности клеток костного мозга, лимфоидной ткани и периферической крови, стимулируя их продукцию цитокинов, а также принимает участие в процессе миграции ДК (). Повышенная регуляция CD38 служит маркером активации клеток, в частности процесса дифференцировки В-лимфоцитов в плазмоциты. При изучении количества CD38+фенотипа в пуле недифференцированных клеток миелоидного ряда перед контактом с образцами и ЛПС определено их содержание19,29±1,74 %. В динамике взаимодействия данных клеток с ЛПС количество CD38+возрастало, при максимальном значении через 3 с инкубации, показатель составил 98,2±9,7 %. Тогда как, в образцах, инкубированных с магнием, выявлено повышение количества CD38+клеток на 2 сутки (91±8,92 %) при последующем понижении до конца срока наблюдения (28±2,4 %). При контакте с титаном максимальное содержание CD38+клеток наблюдалось только на 9 с инкубации, и их показатель составил 82±7,8 %. Приведенные выше данные свидетельствуют о наличии индуцирующего действия имплантатов на созревание ДК, в зависимости от времени контакта, причем в большей степени магния, чем титана.
Заключение
В процессе созревания ДК отмечается снижение эндоцитарного потенциала, степени экспрессии антигенраспознающих рецепторов, и, напротив, увеличивается экспрессия молекул адгезии, которые связаны с плазматической мембраной. Толерантные свойства высокодифференцированных ДК в запуске иммунного ответа проявляются не только их способностью презентировать антигены лимфоцитам, но и уникальными миграционными свойствами, которые позволяют им присоединять антигены в различных тканях организма и транспортировать их в региональные лимфоидные органы. Помимо того, что у этих клеток изменяется морфология клеточных органелл, повышается активность лизосомальных ферментов и иммунопротеасом, осуществляющих процессинг синтезируемых внутриклеточно белковых антигенов, усиливается производство провоспалительных цитокинов и различных факторов роста, посредством которых активируются Т-лимфоциты и клетки соединительнотканного происхождения [3, 12, 13]. Указанные уникальные свойства позволяют ДК быть важными участниками процесса регенерации костной ткани в качестве инициаторов остеолизиса, активируя дифференцировку и созревание остеокластов.
Представленные данные указывают на одинаковое относительно друг друга влияние имплантатов на экспрессию рецептора адгезии CD34 гемопоэтических клеток, а сниженный, относительно контроля, процент содержания этих клеток - на их действие в качестве индукторов созревания. Обозначено более выраженное, по сравнению с титаном, влияние магния на направленность дифференцировки клеток гемопоэтического пула преимущественно в сторону дендритных. С этой позиции выявленная в нашем исследовании свойство биорезорбируемого магниевого имплантата оказывать более выраженное влияние, по сравнению с биоинертным титановым, на процесс направленной дифференцировки и созревания ДК представляет особенный интерес. В этом случае, когда по истечении определенного временного промежутка после внедрения в место повреждения магний резорбируется остекластами и другими профессиональными фагоцитами, большое значение имеют уже присутствующие в месте асептического воспаления высокодифференцированные ДК. Эти клетки в силу того, что они уже приобрели свойства высокоспециализированных антигенпредставляющих участников процесса элиминации нежелательных компонентов воспаления, также могут оказывать опосредованный эффект на процесс остеосинтеза путем продукции разнообразных факторов, в том числе цитокинов, в межтканевое пространство для привлечения соединительнотканных клеточных элементов. Выявленная нами относительно невысокая степень активирующего воздействия титанового имплантата на ДК подтверждает его свойство биоинертности в отношении иммунной системы, что указывает на его положительные качества, как материала, который длительно находится в организме.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (гос. контракт № 14-33-00009) и Федерального агентства научных организаций.
Рецензенты:
Палагина М.В., д.б.н., профессор, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дальневосточный федеральный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации, г. Владивосток;
Тимченко Н.Ф., д.м.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и микробиологии, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», г. Владивосток.