Гематотоксические осложнения занимают лидирующую позицию в ряду побочных эффектов противоопухолевой химиотерапии. Уменьшение или предупреждение гематотоксичности основано на применении в качестве гематопротекторов витаминов, нуклеиновых кислот, цитокинов [3] с ограниченным успехом. Изучение гематопротекторных свойств антиоксидантов разных классов основано на патогенетической значимости активации свободнорадикальных процессов в развитии гематотоксических реакций. При этом интенсификация перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов и плазме крови с последующим развитием функциональной неполноценности клеток красной крови в сочетании с анемией ведут к усилению гипоксии, усугубляя течение основного патологического процесса[1]. Ранее показано миелопротекторное действие мексидолаи эмоксипинапри использовании алкилирующихцитостатиков, доксорубицина и этопозида в эксперименте [6, 7]. Не исключено, что в реализации гематопротекторного действия определенную роль играет прямое действие мексидола на митохондриальные процессы в эритроидных клетках, где происходит синтез гемоглобина [2]. Производное пиримидина ксимедон, обладающий антиоксидантными свойствами, эффективнее мексидола уменьшает степень тяжести анемии у животных при химиотерапии доксорубицином и паклитакселом[8].
Вместе с тем, снижение эффективности переноса кислорода эритроцитами может быть связано и с изменениями свойств гемоглобина, определяющих его сродство к кислороду и распределение в клетке[4], что вносит свой вклад в усиление гипоксии. Влияние средств, обладающих антиоксидантным действием - мексидола и ксимедона - на структурный и функциональный статус гемоглобина при проведении антибластомной химиотерапии до сих пор не изучено.
Цель исследования - оценить изменения молекулярного состояния гемоглобина у крыс с карциномой Walker-256 при введении ксимедона и мексидола при комбинированной химиотерапии доцетакселом и доксорубицином.
Материал и методы исследования. Эксперименты выполнены на 35крысах-самках линииWistar массой 150-250 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария Мордовского государственного университета при естественном световом режиме на стандартной диете, свободном доступе к воде и пище. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Суспензию клеток карциномы Walker-256 (W-256) (106 клеток в растворе Хенкса) перевивали под кожу хвоста. Животные были распределены на 5 групп. Дизайн исследований представлен в табл. 1.
Таблица 1
Дизайн исследований
|
Группы |
Режим эксперимента |
|
Интактные животные (n=7) |
Опухолевые клетки W-256 не вводили, лекарственная терапия не проводилась |
|
1-я - опухолевый штамм W-256 (контроль) (n=7) |
1·106 опухолевых клеток W-256под кожу хвоста |
|
2-я - W-256, Доксорубицин, Доцетаксел - W-256+ДР+ДТ (n=7) |
1·106 опухолевых клеток W-256, доксорубицинв дозе 4 мг/кг и доцетаксел в дозе 11,5 мг/кг внутрибрюшинно на 11-е сутки после имплантации опухолевых клеток |
|
3-я - W-256, Доксорубицин, Доцетаксел, Ксимедон100 мг/кг-W-256+ДР+ДТ+Ксимедон (n=7) |
Так же, как и во2-й группе, ксимедон внутримышечно в дозе 100 мг/кг ежедневно, начиная с 11-х суток эксперимента, 10 суток |
|
4-я - W-256, Доксорубицин, Доцетаксел, Мексидол 50 мг/кг - W-256+ДР+ДТ+Мексидол (n=7) |
Так же, как и во2-й группе, мексидол внутримышечно в дозе 50 мг/кг ежедневно, начиная с 11-х суток эксперимента, 10 суток |
У6-7 животных из каждой группы на 14-е и 22-е сутки эксперимента проводили забор крови кардиальной пункцией под общей анестезией тиопенталом-натрия (50 мг/кг), кровь гепаринизировали, затем готовили мазок на предметном стекле. Исследование выполнялось с помощью рамановского спектрометра inviaBasis, для получения спектров гемопорфирина гемоглобина использовался микроскоп с регистрацией комбинационного рассеяния света inviaBasis фирмы Renishawс короткофокусным высокосветосильным монохроматором (фокусное расстояние не более 250 мм), длина волны излучения используемого лазера составляла 532 нм, мощность излучения 100 мВт, объектив 50×. Регистратор данных -CCDдетектор (1024×256 пикселей с пельтье-охлаждением до -70°С) с решеткой 1800 штр/мм. Оцифрованные спектры обрабатывались в программе WIRE 3.3. Производилась коррекция базовой линии, сглаживание спектров. Наличие полос в РАМАН-спектре при исследовании конформации и свойств гемоглобина отражает структурное и функциональное состояние гемоглобина и позволяет на молекулярном уровне оценить его потенциальные возможности. Спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) позволяет исследовать состояние атома железа и лигандов, связанных с ним, по изменению структуры тетрапиррольного цикла гемопорфирина гемоглобина. Для анализа конформации и О2-связывающих свойств гемоглобина использовали следующие полосы КР спектров эритроцитов (указаны положения максимумов): 1172, 1355, 1375, 1548-1552, 1580-1588, 1618, 1668 см-1[5].
При статистической обработке результатов исследования определяли показатели средних арифметических значений (М), стандартных ошибок средних арифметических (m). Нормальность распределения проверяли с использованием теста Колмогорова-Смирнова. При условии соответствия нормальности распределения достоверность полученных различий сопоставляемых величин оценивали с использованиемt-критерия Стьюдента. При несоответствии нормальности распределения достоверность различий оценивали с использованием U-критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение.Полученные данные продемонстрировали, что содержание оксигемоглобина в эритроцитах у животных 1-ой группы (контрольной) на 14-е сутки эксперимента достоверно снижалось на 6% на фоне роста доли комплексов гемоглобина с NOпри отсутствии связи между атомом Fe2+ и глобином (на 61%, р<0,01) и числа комплексов гемоглобина с NOпри наличии связи между атомом Fe2+ и глобином (на 25%, р<0,01) по сравнению с интактными крысами (табл. 2).
Таблица 2
РАМАН-спектроскопия гемоглобина эритроцитов у крыс с карциномой W-256 при введении ксимедона и мексидола на фоне химиотерапии доксорубицином и доцетакселом (14-е сутки эксперимента), (M±m)
|
Показатель |
Экспериментальные группы |
||||
|
Интактные |
1 - W-256 контроль |
2 - W-256+ ДР+ДТ |
3 - W-256+ ДР+ДТ+ ксимедон |
4 - W-256+ ДР+ДТ+ мексидол |
|
|
Доля оксигемоглобина в эритроцитах (I1375/(I1355+I1375) |
0,66±0,006 |
0,62±0,01 р1<0,001 |
0,57±0,01 р1,2<0,01 |
0,55±0,004 р1,2<0,001 |
0,61±0,007 р1,3,4<0,001 |
|
Способность гемоглобина связывать лиганды (I1355/I1550) |
0,62±0,01
|
0,67±0,03
|
0,88±0,03 р1,2<0,001
|
0,86±0,01 р1,2<0,001
|
0,67±0,01 р1,3,4<0,05
|
|
Способность гемоглобина выделять лиганды (I1375/I1580) |
0,66±0,01
|
0,67±0,02
|
0,78±0,01 р1,2<0,001 |
0,8±0,01 р1,2,3<0,05 |
0,67±0,01 р3,4<0,001 |
|
Сродство гемоглобина к кислороду (I1355/I1550)/(I1375/I1580) |
0,95±0,02
|
1,0±0,03
|
1,15±0,04 р1,2<0,05 |
1,04±0,02 р1,3<0,05 |
1,0±0,02 р3<0,01 |
|
Выраженность симметричных и асимметричных колебаний пиррольных колец (I1375/I1172) |
1,4±0,03
|
1,3±0,05
|
0,97±0,04 р1,2<0,001
|
1,1±0,03 р1,2,3<0,05 |
1,2±0,04 р1,2,3<0,05 |
|
Доля комплексов гемоглобина с NO при отсутствии связи между атомом Fe2+ и глобином (I1668/I1580) |
0,18±0,008
|
0,29±0,04 р1<0,01 |
0,26±0,01 р1<0,001
|
0,5±0,01 р1,2,3<0,001
|
0,2±0,007 р1,2,3,4<0,05
|
|
Доля комплексов гемоглобина с NO при наличии связи между атомом Fe2+ и глобином (I1618/I1580) |
0,4±0,007
|
0,5±0,03 р1<0,01 |
0,5±0,01 р1<0,001
|
0,7±0,01 р1,2<0,001
|
0,46±0,007 р1,3,4<0,01
|
Примечание: р1 - достоверность различий рассчитана по отношению к интактным животным; р2 - к группе 1; р3 - к группе 2; р4 - к группе 3.
Известно, что сродство NO к атому Fe2+гема выше, чем кислорода, поэтому NO способен конкурировать с кислородом за связывание гемоглобином.
Химиотерапия доксорубициномс доцетакселом(во 2-ой группе животных) сопровождалась ухудшением кислородтранспортной функции гемоглобина, что проявлялось снижением содержания оксигемоглобина в эритроцитах на 13,6% (р<0,01) в сочетании с достоверным ростом доли комплексов гемоглобина с NOпри отсутствии и наличии связи между атомом Fe2+ и глобином на 44% и 25% соответственно по отношению к интактным животным. Данные изменения сопровождались статистически значимым увеличением сродства гемоглобина к кислороду на 21%, что может уменьшать поступление кислорода к тканям, а также способности гемоглобина связывать и выделять лиганды (на 42 и 18% соответственно) в сравнении с интактными крысами (табл. 2). Выраженность симметричных и асимметричных колебаний пиррольных колец достоверно уменьшалась по сравнению с интактными животными, что свидетельствует об определенных конформационных изменениях молекулы гемоглобина.
Дополнительное введение ксимедонана фоне терапии доксорубицином и доцетакселом(в 3-й группе) проявлялось схожими изменениями: доля оксигемоглобина, способность гемоглобина связывать лиганды не отличались от таковых во 2-ой группе животных. Сродство гемоглобина к кислороду при этом снижалось на 9,5%, что облегчает отдачу кислорода в тканях, а способность гемоглобина выделять лиганды увеличивалась на 2,5% по сравнению с животными 2-ой группы (р<0,05, табл. 2). Выраженность симметричных и асимметричных колебаний пиррольных колец приближалась к соответствующему показателю у интактных крыс, однако также оставалась достоверно меньше. Доля комплексов гемоглобина сNOпри отсутствии и наличии связи между атомом Fe2+ и глобином возрастала в 2,7 и 1,75 раза соответственно в сравнении с интактными животными (р<0,001). Следует отметить, что комплекс гемоглобина с NO при отсутствии связи между белком и гемопорфирином регулирует способность гемоглобина отдавать кислород.
В 4-й группе животных (с введением мексидола на фоне терапии доксорубицином и доцетакселом) доля оксигемоглобина в эритроцитах возрастала на 7% по отношению ко 2-й группе (без введения мексидола), нормализовывались способность гемоглобина выделять лиганды и сродство гемоглобина к кислороду. Выраженность симметричных и асимметричных колебаний пиррольных колец сохранялась меньшей, чем у интактных животных, однако отмечалась тенденция к нормализации и этого показателя (достоверно увеличивался на 23% по отношению к животным 2-й группы). Доля комплексов гемоглобина с NOпри отсутствии и наличии связи между атомом Fe2+ и глобином достоверно снижалась по сравнению с животными, получавшими только доксорубицин и доцетаксел, на 23% и 8% соответственно (табл. 2).
К 22-м суткам эксперимента у животных контрольной группы доля оксигемоглобина в эритроцитах снижалась на 24% (р<0,001) по сравнению с интактными животными, что является закономерным в связи с развитием анемии. При этом способность гемоглобина связывать и выделять лигандыдостоверно повышалась на 45% и 21% на фоне роста сродства гемоглобина к кислороду на 15,8% по отношению к интактным крысам. Доля комплексов гемоглобина с NO при отсутствии связи между атомом Fe2+ и глобином в 3 раза превышала соответствующий показатель у интактных животных, а содержание комплексов гемоглобина с NO при наличии связи между атомом Fe2+ и глобином - в 1,8 раза (р<0,001) (табл. 3.).
Таблица 3
РАМАН-спектроскопия гемоглобина эритроцитов у крыс с карциномой W-256 при введении ксимедона и мексидола на фоне химиотерапии доксорубицином и доцетакселом (22-е сутки эксперимента), (M±m)
|
Показатель |
Экспериментальные группы |
||||
|
Интактные |
1 - W-256 контроль |
2 - W-256+ ДР+ДТ |
3 - W-256+ ДР+ДТ+ ксимедон |
4 - W-256+ ДР+ДТ+ мексидол |
|
|
Доля оксигемоглобина в эритроцитах (I1375/(I1355+I1375) |
0,66±0,006 |
0,5±0,005 р1<0,001 |
0,59±0,01 р1,2<0,001 |
0,53±0,007 р1,3<0,001 |
0,56±0,009 р1,2,3,4<0,05 |
|
Способность гемоглобина связывать лиганды (I1355/I1550) |
0,62±0,01
|
0,9±0,01 р1<0,001
|
0,73±0,02 р1,2<0,001
|
0,9±0,03 р1,3<0,001
|
0,8±0,02 р1,2,3,4<0,05
|
|
Способность гемоглобина выделять лиганды (I1375/I1580) |
0,66±0,01
|
0,8±0,01 р1<0,001
|
0,68±0,01 р2<0,001 |
0,8±0,01 р1,3<0,001 |
0,68±0,009 р2,4<0,001 |
|
Сродство гемоглобина к кислороду (I1355/I1550)/(I1375/I1580) |
0,95±0,02
|
1,1±0,02 р1<0,001
|
1,05±0,05
|
1,1±0,04 р1<0,001 |
1,13±0,03 р1<0,01 |
|
Выраженность симметричных и асимметричных колебаний пиррольных колец (I1375/I1172) |
1,4±0,03
|
0,9±0,03 р1<0,001
|
1,07±0,05 р1,2<0,05
|
1,02±0,03 р1<0,001 |
0,94±0,05 р1<0,05 |
|
Доля комплексов гемоглобина с NO при отсутствии связи между атомом Fe2+ и глобином (I1668/I1580) |
0,18±0,008
|
0,55±0,02 р1<0,001 |
0,2±0,01 р2<0,001
|
0,58±0,01 р1,3<0,001
|
0,19±0,007 р2,4<0,001
|
|
Доля комплексов гемоглобина с NO при наличии связи между атомом Fe2+ и глобином (I1618/I1580) |
0,4±0,007
|
0,7±0,02 р1<0,001 |
0,5±0,02 р1,2<0,01
|
0,7±0,02 р1,3<0,001
|
0,46±0,005 р1,2,4<0,001
|
Примечание: р1 - достоверность различий рассчитана по отношению к интактным животным; р2 - к группе 1; р3 - к группе 2; р4 - к группе 3.
Во 2-й группе (с использованием только доксорубицина и доцетаксела) содержание оксигемоглобина на 22-е сутки эксперимента снижалось по сравнению с интактными крысами на 11% , способность гемоглобина связывать лигандыдостоверно возрастала по отношению к интактным животным, а сродство к кислороду и способность выделять лиганды - нормализовывались. Выраженность симметричных и асимметричных колебаний пиррольных колец на 23% уменьшалась по сравнению с интактными животными (р<0,05). Доля комплексов гемоглобина с NO при отсутствии связи между атомом Fe2+ и глобином не отличалась от таковой у интактных крыс, а содержание комплексов гемоглобина с NO при наличии связи между атомом Fe2+ и глобином в 1,25 раза превышала исходный уровень (р<0,01, табл. 3).
В 3-й группе животных (с ксимедоном)содержание оксигемоглобина в эритроцитах, способность гемоглобина связывать и выделять лиганды, сродство к кислороду, выраженность симметричных и асимметричных колебаний пиррольных колец и доля комплексов гемоглобина с NO при отсутствии и наличии связи между атомом Fe2+ и глобином не отличались от уровня соответствующих показателей контрольных животных.
В 4-й группе животных (с мексидолом) доля оксигемоглобина в эритроцитах оставалась ниже исходного показателя на 15%. Способность гемоглобина связывать лигандыдостоверно превышала таковую во 2-й группе на 9,5%, а выделять лиганды - не отличалась от исходного показателя. Сродство гемоглобина к кислороду и выраженность симметричных и асимметричных колебаний пиррольных колец не отличались от таковых в контрольной группе, а доля комплексов гемоглобина с NO при отсутствии и наличии связи между атомом Fe2+ и глобином не отличались от уровня соответствующих показателей во2-й группе животных (табл. 3).
Заключение.Таким образом, мексидол эффективнее ксимедона корригирует ассоциированные с введением доксорубицина и доцетаксела изменения молекулярной структуры гемоглобина, что повышает его кислородтранспортную функцию и проявляется увеличением количества оксигемоглобина, нормализацией сродства гемоглобина к кислороду и способности выделять лиганды, уменьшением содержания в эритроцитах комплексов гемоглобина с NO. Временный характер этих изменений может быть обусловлен влиянием опухолевого процесса.
Рецензенты:
Зорькина А.В., д.м.н., профессор, зав. кафедрой поликлинической терапии и функциональной диагностики с курсом эндокринологии, Медицинский институт, ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск;
Скопин П.И., д.м.н., доцент кафедры онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии, Медицинский институт, ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск.