На сегодняшний день нарушения мозгового кровообращения, в частности ишемический инсульт, являются одной из ведущих причин, приводящих к смерти человека либо его инвалидности [1]. Высокая частота смертности и первичной инвалидности от данной цереброваскулярной патологии связана с многофакторным повреждающим действием на головной мозг. Среди этих факторов не последнюю роль играет дисфункция эндотелия сосудов [2,7], что открывает перспективное направление фармакологической коррекции ишемического инсульта, а именно – целенаправленное терапевтическое воздействие на эндотелиоциты мозговых сосудов. Однако функциональное состояние эндотелия (его вазодилатационная функция и антитромботический потенциал) при нарушениях мозгового кровообращения ишемического генеза изучены недостаточно [2], что и предопределило цель настоящего исследования.
Цель исследования. Целью данной работы являлось экспериментальное изучение вазодилатирующей и антитромботической функций эндотелия сосудов головного мозга крыс на различных моделях его ишемического повреждения.
Материалы и методы. Исследование реализовано на 60 крысах-самцах линии Wistar, разделенных на 5 равных экспериментальных групп, по 12 особей. Первая группа – интактные животные (ИЖ). Ишемическое повреждение головного мозга воспроизводили у наркотизированных хлоралгидратом (350 мг/кг) животных на четырех моделях: правосторонняя окклюзия средней мозговой артерии (ПОСМА), с трехдневным периодом ишемии, восьмичасовая билатеральная окклюзия общих сонных артерий (БОСА), четырехдневная ипсилатеральнаяокклюзия правой общей сонной артерии (ПОСА), ишемия – реперфузия (ИР), с пятиминутным периодом ишемии [3,6]. По истечении указанного времени проводили оценку вазодилатирующей и антитромботической функций эндотелия сосудов головного мозга крыс.
Вазодилатирующую функцию оценивали путем измерения скорости мозгового кровотока (средней систолической скорости – Ск) в проекции правой средней мозговой артерии, при модификации синтеза эндогенного оксида азота. Скорость мозгового кровотока регистрировали с помощью ультразвукового допплерографа, датчика УЗОП-010-01 с рабочей частотой 25МГц и компьютерной программы ММ-Д-К-MinimaxDoppler v.1.7. (Санкт-Петербург, Россия). Модификацию синтеза эндогенного NO осуществляли введением тест – систем: ацетилхолин (АЦХ) 0,1 мг/кг (Sigma-Aldrich), L-аргинин 150 мг/кг (Panreac), нитро-L—аргинин метиловый эфир (L- NAME) 15 мг/кг (Sigma-Aldrich) в левую бедренную вену.
Антитромботическую функцию эндотелия оценивали по способности тромбоцитов к агрегации. Процесс агрегации тромбоцитов регистрировали с помощью двухканального лазерного анализатора агрегации тромбоцитов АЛАТ – 2 «БИОЛА» (НПФ «БИОЛА», Россия), методом определения относительного среднего размера агрегатов. В качестве индуктора агрегации использовали АДФ (НПО «Ренам») в конечной концентрации 5мкМ. При этом определяли степень (СтАТ) и скорость агрегации (СкАТ) тромбоцитов.
Результаты опытов обрабатывали методом вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., США для операционной системы Windows). Вычисляли среднее значение и стандартную ошибку среднего значения. Полученные данные проверяли на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро – Уилка. В случае нормального распределения данных для сравнения средних использовали t-критерий Стьюдента. При ненормальном распределении результатов эксперимента дальнейшую статистическую обработку данных проводили с использованием U- критерия Манна – Уитни.
Результаты и обсуждение
Исходная скорость локального мозгового кровотока у интактных животных составляла, 4,59±0,44 см/сек. Внутривенное введение АЦХ крысам данной группы привело к увеличению Ск на 54 % (p>0,01), в то время как введение L-аргинина не оказало значимого влияния на уровень мозгового кровотока (Рис.1). Блокада системы синтеза оксида азота посредством внутривенного введения L-NAME вызвало снижение Ск на 20,3 % (p>0,05). Полученные данные согласуются с литературными источниками [4,7].
В результате окклюзии правой средней мозговой артерии скорость кровотока падает в 1,9 (p>0,05) раза, до значения 2,398±0,22 см/сек. Стимулированный ацетилхолином выброс оксида азота вызвал у данной группы крыс значительно меньший, чем у интактных животных, сосудистый ответ (скорость локального мозгового кровотока увеличилась лишь на 19 %). В то же время внутривенное введение крысам с ПОСМА L-аргинина – субстрата синтеза оксида азота привело к увеличению Ск на 31,8 % (p>0,05), что, по всей видимости, может свидетельствовать о развитии феномена «L – аргининового парадокса», который в свою очередь является одним из маркеров эндотелиальной дисфункции [7]. При введении L-NAME у данной группы животных Ск снизилась только на 11,8 % от ее исходного уровня, что, вероятно, объясняется меньшей, чем у ИЖ, активностью ферментных систем, ответственных за синтез NO [4]. В совокупности, полученные данные позволяют предположить, что в условиях ПОСМА наблюдается нарушение вазодилатационной функции эндотелиоцитов сосудов головного мозга крыс.
У животных с билатеральной окклюзией общих сонных артерий скорость мозгового кровотока после оперативного вмешательства составила, 2,264±0,24 см/сек. Последующее введение эндотелий-специфичных анализаторов позволило выявить следующую тенденцию. Также как и у животных с ПОСМА у данных крыс наблюдается сниженная (по сравнению с ИЖ) сосудистая реакция в ответ на введении АЦХ (прирост кровотока от его первоначальных значений составил 17,7 %). Однако реакция сосудов на введение L-аргинина носила менее выраженный характер, чем у животных с ПОСМА (Рис. 1). Изменение Ск у животных с БОСА при введении данного анализатора составило +18,8 % (p>0,05).
Примечание: * – достоверно относительно исходного значения (p>0,01),
∆ – достоверно относительно исходного значения (p>0,05).
Рис.1. Изменение скорости локального мозгового кровотока, у животных с ПОСМА, БОСА и ИР на фоне введения эндотелий-специфичных анализаторов
Внутривенное введение нитро – L-аргинин метилового эфира данной группе животных привело к падению скорости локального мозгового кровотока на 16,3 %, что меньше аналогичного показателя ИЖ в 1,2 раза (p>0,05). Полученные результаты позволяют предположить, что экспериментально смоделированная ишемия головного мозга путем билатеральной окклюзии общих сонных артерий приводит к развитию эндотелиальной дисфункции.
У группы крыс с ипсилатеральной окклюзией правой общей сонной артерии исходная скорость кровотока при оценке вазодилатирующей функции эндотелия составляла, 4,164±0,299 см/сек. При введение АЦХ у данной группы крыс наблюдалось как увеличение скорости кровотока – на 15,7, % (Рис.2) (подгруппа 1) так и ее уменьшение – на 8,9 % (подгруппа 2), что, по всей видимости, может служить одним из признаков нарушения нормального функционирования эндотелия [5]. На фоне введения L-аргинина прирост скорости кровотока у животных, у которых имела место положительная реакция на АЦХ, составил 21,5 % (p>0,05), а у крыс с отрицательной реакцией на введение ацетилхолина – 8,7 %. Внутривенное введение L-NAMEкрысам с ПОСА в обеих подгруппах животных вызвало повышение Ск на 6 % и 4,6 % (подгруппа 1 и подгруппа 2 соответственно), что вероятно связано с разобщением синтеза оксида азота на уровне ферментных систем [5]. Вариабельность сосудистого ответа на введение АЦХ повышение скорости кровотока в ответ на введение L-аргинина и нитро – L-аргинин метилового эфира дают основание предполагать, что при ипсилатеральной окклюзии правой общей сонной артерии наблюдается нарушение эндотелий опосредованная продукция вазоактивных соединений.
Примечание: * – достоверно относительно исходного значения (p>0,05).
Рис.2. Изменение скорости локального мозгового кровотока, у животных с ПОСА на фоне введения эндотелий-специфичных анализаторов
Первоначальная скорость мозгового кровотока у животных с ишемией - реперфузиейголовного мозга составляла, 3,886±0,3 см/сек. По истечении 5-ти минутного периода ишемии у данной группы животных при восстановлении кровотока наблюдались явления гиперперфузии, и, как следствие этого, Ск увеличилась на 10,1 %. После восстановления уровня мозгового кровотока до его исходных значений, осуществляли оценку вазодилатационнной функции эндотелия. При введении ацетилхолина данным животным Ск увеличилась на 18,8 %, также данный показатель увеличился и при введении L -аргинина – на 12,6 %. На фоне L-NAME у животных группы ИР скорость мозгового кровотока снизилась на 13,4 %. Полученные результаты позволяют предположить у крыс после перенесенной 5-ти минутной ишемии с последующей реперфузией развивается нарушение вазомоторной функции эндотелия.
Анализ тромбоцитарного звена гемостаза показал, что при всех воспроизводимых в работе экспериментальных моделях ишемии головного мозга наблюдается повышение, относительно группы интакта, как степени, так и скорости агрегации тромбоцитов (у ИЖ значения данных показателей составляли 1,384±0,07 ус. ед и 0,647±0,125 ус. ед соответственно) (Рис. 3). В результате правосторонней окклюзии средней мозговой артерии, исследуемые показатели тромбоцитарного гемостаза увеличились соответственно в 1,56(p>0,01) и 4,2 (p>0,001) раза.
Примечание: * – достоверно относительно интактной группы животных (p>0,01),
∆ – достоверно относительно интактной группы животных (p>0,001),
# – достоверно относительно интактной группы животных (p>0,02).
Рис.3. Изменение показателей процесса агрегации тромбоцитов при различных способах моделирования ишемии головного мозга
У животных с БОСА степень агрегации тромбоцитов увеличилась относительно итнактной группы крыс в 2,15 (p>0,02), в то же время рост скорости агрегации тромбоцитов составил 300 % (p>0,02). При ипсилатеральной окклюзии правой общей сонной артерии СтАТ увеличилась в 1,7 (p>0,01) раза, а СкАТ3,7 (p>0,01) раза. В группе ИР степень и скорость агрегации тромбоцитов увеличились в 1,5 (p>0,01) и 5 (p>0,001) раз соответственно (Рис.3).
Выводы. В результате проведенного исследования установлено, что при всех, реализованных в работе, моделях ишемии головного мозга развивается нарушение вазодилатирующей и антитромботической функций эндотелия сосудов, сопровождаемое снижением вазореактивности к АЦХ и нитро – L-аргинин метиловому эфиру, развитием феномена «L – аргининового парадокса», повышением степени и скорости агрегации тромбоцитов. При этом наиболее выраженные изменения вазодилатирующей функции отмечены при окклюзии правой средней мозговой артерии, т.к. при сопоставимых (с другими моделями) значениях скорости мозгового кровотока в ответ на введение ацетилхолина и нитро- L-аргинин метилового эфира, явление «L-аргининового парадокса» носило более выраженный характер (скорость локального мозгового кровотока увеличилась на 31,8 % (p>0,05). Антитромботическая функция эндотелия претерпела существенные изменения на модели билатеральной окклюзии общих сонных артерий, т.к. при воспроизведении данной методики степень агрегации тромбоцитов была выше (2,971±0,465 ус. ед), чем при остальных вариантах ишемии головного мозга, при сопоставимых значениях скорости агрегации тромбоцитов.
Рецензенты:
Черников М.В., д.м.н., профессор, зав. кафедрой биологии и физиологии ГБОУ ВПО Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала Волгоградского государственного медицинского университета, г. Волгоград;
Погорелый В.Е., д.б.н., профессор кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии ГБОУ ВПО Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала Волгоградского государственного медицинского университета, г. Волгоград.