В большинстве случаев используются сложные фиксаторы, включающие смесь соединений с высокой химической активностью: органические растворители, окислители, восстановители, буферные системы, вещества, вызывающие конформационные изменения внутриклеточных макромолекул, и др. [9 и др.]. Многие составы и концентрации фиксирующих реагентов, входящих в сложные фиксаторы, определены эмпирическим путем, и механизмы взаимодействия реагентов между собой в фиксаторе и с фиксируемыми клетками часто не изучены. Это приводит к увеличению «неопределенности» полученных результатов [6].
Фиксатор, в состав которого входят хромовая кислота, формальдегид и ледяная уксусная кислота, в литературе известен как фиксатор Навашина. Данная смесь была предложена С.Г. Навашиным в 1912 году для гистологической фиксации растительных объектов и активно используется до настоящего времени [1; 3; 4].
Хорошо известно, что соединения Cr (VI) представляют сильные окислители, а формальдегид является активным восстановителем. Однако кинетика окислительно-восстановительных реакций в фиксаторе Навашина между хромовой кислотой, формальдегидом и уксусной кислотой не исследована, хотя все, кто использовал этот фиксатор, наблюдали быстрое и резкое изменение цвета фиксатора после слияния указанных реагентов.
В данной работе представлены результаты спектрального анализа восстановления Cr (VI) до Cr (III), и кинетики реакций, связанных с восстановлением хрома формальдегидом в присутствии уксусной кислоты (пропорции взаимодействующих реагентов соответствуют смеси фиксатора Навашина).
Материал и методы
Все измерения спектров изученных растворов проводились на спектрофотометрах Specord UV (Цейс, Германия) и Chimadzu UV-2401PC (Япония). Растворы готовились на дистиллированной воде из следующих реагентов: хромовый ангидрид, 37%-ный раствор формалина и ледяная уксусная кислота. Состав фиксатора Навашина: 1%-ный раствор CrO3,
16%-ный раствор формалина и ледяная уксусная кислота в пропорции 10:4:1 (v/v). Концентрация хромовой кислоты в фиксаторе Навашина равна 7х10-2 М.
Исходный раствор CrO3 (концентрация 0,1 М) имеет значения оптической плотности (D) значительно выше 2,0. Чтобы записывать спектры поглощения раствора CrO3 в пределах 1,4 D (шкала спектрофотометра Спекорд), использовались разбавление исходного раствора CrO3 в 100 раз и кюветы толщиной 0,5 см. Аналогично измерялись спектры поглощения раствора фиксатора Навашина.
Измерение спектров в длинноволновой части спектра (ионы Cr (III)) проводилось без разведения исходного раствора фиксатора в кюветах толщиной 2 мм.
Результаты измерений
1. Спектр поглощения хромовой кислоты (водный раствор CrO3)
Спектр поглощения хромовой кислоты в концентрации 10-3 М имеет три полосы поглощения: два пика в ультрафиолетовой области - 258 нм и 351 нм и один, минорный, плохо разрешенный пик, в области 436 нм. В табл. 1 приведены цифровые значения D в области максимумов спектра (Шимадзу).
Таблица 1
Значения D в максимумах спектра раствора CrO3
|
|
D (толщина кюветы - 0,5 см) |
||
|
|
258 нм |
351 нм |
436 нм |
|
1. Раствор CrO3 (10-3 М) |
1,134 |
0,837 |
0,116 |
|
2. Раствор CrO3 (7х10-4 М) (фиксатор Навашина) |
0,702 |
0,524 |
0,071 |
Результаты измерений калибровочных спектров растворов хромовой кислоты в диапазоне концентраций 10-3 - 10-4 М и расчеты коэффициентов молярной экстинции (e, л / моль× см) приведены в табл. 2.
Таблица 2
Результаты измерения значений оптической плотности для разных концентраций CrO3 и расчета коэффициента молярной экстинции (e, л / моль× см)
|
№ |
Вода, мл |
Рас-твор CrO3 10-3 М, мл |
Концен- трация, М |
Кювета 0,5 см |
||||
|
258 нм |
351 нм |
436 нм D |
||||||
|
D |
e* |
D |
e* |
|||||
|
1 |
9 |
1 |
10-4 |
0,10 |
2000 |
0,08 |
1600 |
0,01 |
|
2 |
8 |
2 |
2 х10-4 |
0,20 |
2000 |
0,16 |
1600 |
.. |
|
3 |
7 |
3 |
3 х10-4 |
0,31 |
2066 |
0,24 |
1600 |
.. |
|
4 |
6 |
4 |
4 х10-4 |
0,42 |
2100 |
0,31 |
1550 |
.. |
|
5 |
5 |
5 |
5 х10-4 |
0,52 |
2080 |
0,39 |
1560 |
.. |
|
6 |
4 |
6 |
6 х10-4 |
0,64 |
2133 |
0,46 |
1533 |
.. |
|
7 |
3 |
7 |
7 х10-4 |
0,74 |
2114 |
0,54 |
1542 |
.. |
|
8 |
2 |
8 |
8 х10-4 |
0,84 |
2100 |
0,62 |
1550 |
.. |
|
9 |
1 |
9 |
9 х10-4 |
0,94 |
2088 |
0,70 |
1555 |
.. |
|
10 |
0 |
10 |
10-3 |
1,06 |
2120 |
0,78 |
1560 |
0,10 |
|
* Расчет коэффициента молярной экстинции e = D/C×l, где D - оптическая плотность, С - концентрация моль/л и l - толщина кюветы в см |
||||||||
2. Спектры поглощения фиксатора Навашина:
а) измерение концентрации ионов хрома (VI). Как отмечено выше, из
свежеприготовленной смеси фиксатора Навашина бралась аликвота, разбавлялась в 100 раз, и сразу же регистрировался спектр разбавленного фиксатора в кювете толщиной 5 мм. Аналогично измерения проводились через разные промежутки времени. Результаты одного из опытов измерения динамики изменения спектров хромовой кислоты приведены в таблице 3.
Таблица 3
Динамика изменения оптической плотности раствора фиксатора Навашина в течение 48 часов после приготовления фиксатора
|
Состав раствора |
Оптическая плотность D |
||||||
|
258 нм |
351 нм |
436 нм |
|||||
|
1 |
10-3 М раствор CrO3 |
D |
% |
D |
%
|
D |
% |
|
1,12 |
0,82 |
0,14 |
|||||
|
2 |
Смесь Навашина (разбавление в 100 раз) 0.00* |
0,78 |
100,0 |
0,66 |
100,0 |
0,10 |
100,0 |
|
3 |
-----«----- 3.30 |
0,38 |
48,7 |
0,26 |
39,4 |
0,04 |
40,0 |
|
4 |
-----«----- 6.30 |
0,32 |
41,0 |
0,20 |
30,3 |
0,04 |
40,0 |
|
5 |
-----«----- 9.30 |
0,28 |
35,9 |
0,16 |
24,2 |
0,02 |
20,0 |
|
6 |
-----«----- 24.00 |
0,24 |
30,8 |
0,04 |
6,1 |
0,02 |
20,0 |
|
7 |
-----«----- 27.30 |
0,22 |
28,2 |
0,04 |
6,1 |
0,02 |
20,0 |
|
8 |
-----«----- 30.30 |
0,22 |
28,2 |
0,04 |
6,1 |
0,02 |
20,0 |
|
9 |
-----«----- 33.00 |
0,18 |
23,1 |
0,04 |
6,1 |
0,02 |
20,0 |
|
10 |
-----«----- 48.00 |
0,18 |
23,1 |
0,03 |
4,5 |
0,02 |
20,0 |
|
* Время в часах от начала измерений |
|||||||
Из данных табл. 3 можно рассчитать начальную скорость изменения оптической плотности (в первые три часа): V (258 нм) = 0,01 D/ч; V (351 нм) = 0,009 D/ч и V (420 нм) = 0,0023 D/ч;
б) измерение концентрации ионов хрома (III). После приготовления в фиксаторе Навашина в спектрах появляется и нарастает максимум в области 580 нм. Данный максимум отражает накопление хрома (III). Результаты одного из опытов, в котором измерялась динамика положения максимума в области 580 нм в течение 48 часов, приведены в таблице 4.
Таблица 4
Динамика изменения оптической плотности фиксатора Навашина в области 580 нм
(толщина кюветы 2 мм)
|
Состав раствора |
D |
% |
|
|
1 |
Смесь Навашина 0.00* |
0,10 |
100,0 |
|
2 |
------«------ 3.30 |
0,26 |
260,0 |
|
3 |
------«------ 6.30 |
0.30 |
300,0 |
|
4 |
------«------ 9.30 |
0.46 |
460,0 |
|
5 |
------«------ 24.00 |
0,48 |
480,0 |
|
6 |
------«------ 27.30 |
0,50 |
500,0 |
|
7 |
------«------- 30.30 |
0,51 |
510,0 |
|
8 |
------«------ 33.00 |
0,53 |
530,0 |
|
9 |
------«------ 48.00 |
0,56 |
560,0 |
Начальная скорость изменения оптической плотности (в первые три часа) в области 580 нм равна V (580 нм) = 0,053 D/ч;
в) Измерение спектров поглощения фиксатора Навашина без уксусной кислоты в длинноволновой части спектра.
Через 24 часа после приготовления смеси фиксатора Навашина раствор приобретал отчетливый темно-зеленый цвет, осадка не наблюдалось. В связи с этим возникло предположение о возможности взаимодействия хрома (III) с уксусной кислотой с образованием ацетата хрома. Для проверки этого предположения были поставлены опыты, в которых вместо уксусной кислоты добавлялся эквивалентный объем дистиллированной воды. Показано, что нарастание оптической плотности раствора фиксатора Навашина без уксусной кислоты значительно ниже, чем в присутствии кислоты. Цвет раствора фиксатора Навашина не был зеленым в случае отсутствия уксусной кислоты даже через 15 и 20 суток после приготовления фиксатора.
Обсуждение результатов
1. Показано, что с момента смешивания реагентов фиксатора Навашина начинается окислительно-восстановительная реакция между компонентами смеси фиксатора. Происходит восстановление Cr (VI) до Cr (III). Восстановление Cr (VI) до Cr (III) должно сопровождаться образованием муравьиной кислоты и уменьшением концентрации формальдегида. Данные об окислительно-восстановительных потенциалах хроматов приведены в нескольких работах [см. 7].
2. Таким образом, фиксатор Навашина представляет неустойчивую в химическом отношении смесь, и фиксация происходит в нестационарном растворе переменного состава, включающем: хромовую кислоту, формальдегид, уксусную кислоту, муравьиную кислоту и ацетат хрома (III).
3. Через 24 часа наблюдается значительное образование Cr (III) и падение концентрации Cr (VI). Продукт реакции с максимумом поглощения в области 580 нм Cr (III), по-видимому, является ацетатом хрома (III).
4. Доказательством того, что максимум 580 нм в спектре фиксатора Навашина связан с образованием ацетата хрома, могут служить результаты двух работ. В патенте о синтезе ацетата хрома формула изобретения сформулирована следующим образом: «Способ получения ацетата хрома на основе хромового ангидрида, уксусной кислоты или ее водного раствора и раствора восстановителя, отличающийся тем, что в качестве раствора восстановителя используют раствор формальдегида... в трехступенчатом реакторе проточного типа...» [5].
Как показали Рудь и соавт., при смешивании растворов хромового ангидрида, уксусной кислоты и формальдегида получается ацетат хрома:
2CrO3 + 6CH3COOH + 3CHOH + 3H2O ® 2(CH3COO)3Cr + 3CHOOH + 6H2O.
Как следует из уравнения реакции, на 1 моль хромового ангидрида требуется 3 моля уксусной кислоты и 1,5 моля формальдегида. Такие условия и разные температуры реагентов (нагрев до 60-70 °С) необходимы для эффективного синтеза ацетата хрома. В фиксаторе Навашина соотношение реагентов следующее: на 1 моль хромового ангидрида приходится 20 молей формальдегида и 17 молей уксусной кислоты. Такое соотношение, т.е. излишек формальдегида и уксусной кислоты, приводит к быстрому восстановлению хрома VI до хрома III и образованию ацетата хрома даже при комнатной температуре.
В другой работе показано, что при восстановлении хрома (VI) в присутствии разных восстановителей (сульфит натрия, аскорбиновая кислота, пероксид водорода) в присутствии уксусной кислоты также образуется ацетат хрома (III) с максимумом поглощения 580-590 нм [2].
5. Действие хрома (III), в частности ацетата хрома, на морфологию клеток недостаточно изучено. Представляют интерес данные о том, что раствор ацетата хрома применяется в качестве протравы при окрашивании ситца. Также известна способность ацетата хрома образовывать сшивки полимерных цепей и регуляции гелеобразования полимерных материалов.
6. Крайне недостаточно данных относительно влияния на клетки муравьиной кислоты, неоднозначны данные о роли уксусной кислоты в составе сложных фиксаторов [10].
7. Известно, что скорость проникновения формальдегида и уксусной кислоты в ткани и модельные системы [6] значительно выше, чем хроматов, приблизительно в 3-4 раза [8]. В связи с этим можно предположить, что собственно фиксация ткани происходит в смеси формальдегида и уксусной кислоты, на фоне которой медленно проникают в ткань продукты восстановленного хрома и других соединений, возникающих в фиксаторе Навашина в ходе окислительно-восстановительной реакции.
8. Механизмы фиксирующего действия хромовой кислоты до конца не изучены. Возможны три варианта: а) прямое коагулирующее действие хроматов на белки, что приводит к их «стабилизации»; б) образование координационных связей с белками, что приводит к образованию прочных связей с протравными красителями (гематоксилин); в) в процессе действия хроматов на тканевые белки включаются оба указанных механизма.
9. На основе результатов данной работы можно предложить двухступенчатый протокол применения фиксатора Навашина: сначала проводить фиксацию в смеси формалин+уксусная кислота и затем, после тщательной промывки, провести обработку хромовой кислотой («хромирование» ткани). Наши данные показывают, что такой протокол фиксации позволит, во всяком случае, избежать действия на ткань дополнительных продуктов окислительно-восстановительной реакции внутри фиксатора Навашина.
Работа поддержана Грантом РФФИ (Проект № 14-08-00-295).
Рецензенты:
Брусков В.И., д.х.н., профессор, заведующий лабораторией, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино;
Мирошников А.И., д.б.н., в.н.с., Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино.