На сегодняшний день ювенильный артрит (ЮА) - это одно из наиболее частых и самых инвалидизирующих ревматологических заболеваний в педиатрической практике [1]. Полиартикулярное поражение в дебюте ЮА выявляется в 13-35% случаев и характеризуется вовлечением в патологический процесс 5 и более суставов в течение первых 6 месяцев болезни [7, 9]. Согласно классификации Международной лиги ревматологических ассоциаций (ILAR), в зависимости от наличия или отсутствия у пациента ревматоидного фактора (РФ) выделяют два клинически и прогностически неидентичных варианта полиартикулярного ЮА: серопозитивный по РФ (РФ-позитивный полиартрит) и серонегативный по РФ (РФ-негативный полиартрит) [7]. Следует отметить, что на долю пациентов с РФ-негативным полиартритом в структуре ЮА приходится около 11-28%, в то время как c РФ-позитивным - только 2-7%, однако в некоторых популяциях наблюдается иное соотношение [7, 9]. Этиология РФ-негативного полиартрита, как и ЮА в целом, до настоящего времени точно не установлена, однако предполагается ее мультифакториальный характер, подразумевающий наличие ряда генетических и средовых факторов риска, в совокупности приводящих к нарушению процессов приобретенного иммунитета и развитию аутоиммунного поражения [5, 7]. Ранее были установлены ассоциации полиморфных локусов некоторых генов семейства интерлейкинов (IL) с развитием различных форм ЮА [4, 8]. Одним из таких генов является IL2RA, кодирующий альфа субъединицу рецептора к IL-2. В норме IL-2, связываясь с рецептором, расположенным на поверхности клеток, участвует в обеспечении процессов аутотолерантности в организме [2]. В то же время показано, что увлечение концентрации растворимой формы IL2RA (sIL-2RA) в сыворотке блокирует активность IL-2 и может иметь значение в формировании предрасположенности к аутоиммунным расстройствам [2].
Ген IL2RA расположен на коротком плече 10 хромосомы в локусе 10p15.1. Одним из наиболее изученных и функционально значимых полиморфных локусов в данной области является rs2104286, для которого ранее зарубежными учеными было показано наличие взаимосвязи с развитием ЮА и других аутоиммунных заболеваний [4, 6].
Цель исследования: изучение возможной взаимосвязи полиморфного локуса rs2104286 гена IL2RA с развитием РФ-негативного полиартрита у детей из Республики Башкортостан.
Материалы и методы исследования
Исследование было одобрено этическим комитетом ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России.После получения добровольного информированного согласия в основную группу было включено 87 пациентов с РФ-негативным полиартритом, состоявших на учете в Республиканской детской клинической больнице (г. Уфа) в 2011-2015 гг., а в контрольную - 194 добровольца без аутоиммунных заболеваний в анамнезе.
Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Изучение полиморфного локуса rs2104286 гена IL2RA проводилось методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (эндонуклеаза рестрикции NdeI, «Fermentas») и верифицировалось методом ПЦР в реальном времени с помощью праймеров и зондов фирмы «ДНК-Синтез» (Россия) на приборе StepOnePlus фирмы «AppliedBiosystems» (США).
Частоты генотипов и аллелей определялись с использованием программы MicrosoftExcel. Для сравнения частот генотипов и аллелей в исследуемых группах рассчитывался точный двусторонний критерий Фишера - p(F) в программе WinPepiv.11.44. Для оценки риска развития заболевания использовался показатель отношения шансов (OR) и 95% доверительный интервал (95%CI) Baptista-Pike (программы MicrosoftExcel, R v.3.2.0 с пакетом "ORCI"). Для проверки возможных моделей наследования и соответствия выборок ожидаемому по Харди-Вайнбергу применялся логистический регрессионный анализ (программа SNPStats [10]). Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты
Средний возраст обследованных пациентов с РФ-негативным полиартритом составил 10,33±0,49 лет, соотношение мальчиков к девочкам 25,3% / 74,7 %, а в контрольной группе - 18,23±0,07 лет и 36,1% / 63,9%, соответственно.
Распределение частот генотипов в группах больных с РФ-негативным полиартритом и в контрольной группе соответствовало ожидаемому по Харди-Вайнбергу (p=0,42 и p=0,58, соответственно), а при проведении сравнительного анализа оказалось сходным в обеих выборках (p=1,000) (таблица 1). Приведенный факт нашел свое подтверждение и при исследовании в программе SNPStats, где ни для одной из моделей наследования не было выявлено значимых различий.
Таблица 1
Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса rs2104286 гена IL2RA в группах пациентов с РФ-негативным полиартритом и здоровых индивидов из Республики Башкортостан
|
Генотипы и аллели |
Пациенты с РФ-негативным полиартритом |
Контроль |
p |
OR (95% CI) |
|||
|
Абс. |
% |
Абс. |
% |
||||
|
AA |
63 |
72,41 |
139 |
71,65 |
1,000 |
1,000 |
1,039 (0,595-1,849) |
|
AG |
21 |
24,14 |
49 |
25,26 |
0,882 |
0,942 (0,525-1,712) |
|
|
GG |
3 |
3,45 |
6 |
3,09 |
1,000 |
1,119 (0,301-4,280) |
|
|
A |
147 |
84,48 |
327 |
84,28 |
1,000 |
1,016 (0,629-1,640) |
|
|
G |
27 |
15,52 |
61 |
15,72 |
1,000 |
0,985 (0,610-1,589) |
|
Далее было выполнено сравнение основной и контрольной групп с учетом гендерных различий. При этом было установлено, что у мальчиков с РФ-негативным полиартритом аллель A и генотип AA встречались значимо чаще (p=0,011; OR=5,486, 95%CI 1,395-24,076 и p=0,016; OR=5,909, 95%CI 1,430-26,884, соответственно), а аллель G и генотип AG - значимо реже, чем у юношей в контроле (p=0,011; OR=0,182, 95%CI 0,042-0,717 и p=0,030; OR=0,204, 95%CI 0,045-0,856, соответственно) (таблица 2). По данным программы SNPStats наиболее удачной оказалась лог-аддитивная модель наследования (p=0,0056; OR=0,18, 95%CI 0,04-0,81).
В то же время, распределение частот генотипов и аллелей у девочек с РФ-негативным полиартритом и в контрольной группе оказалось статистически не отличимым (p=0,248) (таблица 2).
При сравнительном анализе частот генотипов и аллелей между мальчиками и девочками отдельно в основной и контрольной выборках было также отмечено, что в группе с РФ-негативным полиартритом частота аллеля A и генотипа AA была значимо выше, а аллеля G - ниже у мальчиков, чем у девочек (p=0,028 в обоих случаях), в то время как в контрольной группе наблюдалась обратная ситуация (значимое снижение доли генотипа AA у мальчиков в сравнении с девочками (p=0,047), для аллелей выявлена только тенденция (p=0,058)).
Таблица 2
Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса rs2104286 гена IL2RA в группах c пациентов с РФ-негативным полиартритом и здоровых индивидов из Республики Башкортостан с учетом гендерных различий
|
Гендерный признак |
Генотипы и аллели |
Пациенты с РФ-негативным полиартритом |
Контроль |
p |
OR (95% CI) |
|||
|
Абс. |
% |
Абс. |
% |
|||||
|
Девочки/ Девушки |
AA |
43 |
66,15 |
95 |
76,61 |
0,167 |
0,248 |
0,597 (0,302-1,135) |
|
AG |
19 |
29,23 |
26 |
20,97 |
0,213 |
1,557 (0,767-3,038) |
||
|
GG |
3 |
4,62 |
3 |
2,42 |
0,416 |
1,952 (0,444-8,519) |
||
|
A |
105 |
80,77 |
216 |
87,10 |
0,130 |
0,622 (0,359-1,111) |
||
|
G |
25 |
19,23 |
32 |
12,90 |
0,130 |
1,607 (0,900-2,784) |
||
|
Мальчики/ Юноши |
AA |
20 |
90,91 |
44 |
62,86 |
0,016* |
0,0092 |
5,909 (1,430-26,884) |
|
AG |
2 |
9,09 |
23 |
32,86 |
0,030 |
0,204 (0,045-0,856) |
||
|
GG |
0 |
0,00 |
3 |
4,29 |
1,000 |
0,000 (0,000-3,686) |
||
|
A |
42 |
95,45 |
111 |
79,29 |
0,011 |
5,486 (1,395-24,076) |
||
|
G |
2 |
4,55 |
29 |
20,71 |
0,011 |
0,182 (0,042-0,717) |
||
*жирным шрифтом выделены значимые различия
Обсуждение
В нашей работе было выполнено изучение возможной взаимосвязи полиморфного локуса rs2104286 гена IL2RA с развитием РФ-негативного полиартрита у детей из Республики Башкортостан. В общей группе пациентов и у девочек таковой выявлено не было, в то же время, оказалось, что у мальчиков маркерами повышенного риска развития РФ-негативного полиартрита являются аллель А и генотип АА (OR=5,486, 95%CI 1,395-24,076 и OR=5,909, 95%CI 1,430-26,884, соответственно), а пониженного - аллель G и генотип AG (OR=0,182, 95%CI 0,042-0,717 и OR=0,204, 95%CI 0,045-0,856, соответственно). Показано, что в рассматриваемом случае наиболее удачной моделью наследования является лог-аддитивная, согласно которой каждая копия аллеля G вносит дополнительный протективный эффект в отношении риска развития РФ-негативного полиартрита у мальчиков (OR=0,18, 95%CI 0,04-0,81).
Полученные нами результаты согласуются с данными исследований, посвященных изучениюфункциональной значимости полиморфного локуса rs2104286 гена IL2RA и свидетельствующих о наличии ассоциации генотипа АА с повышенным уровнем sIL-2RA в сыворотке как здоровых индивидов, так и пациентов с сахарным диабетом 1 типа и множественным склерозом [6].
По имеющимся сведениям полиморфный локус rs2104286 гена IL2RA изучался при ЮА в ряде зарубежных работ, однако в России подобное исследование проводится впервые [3, 4]. Так,Hinksc соавт. установили, что минорный аллель G данного полиморфного локуса ассоциирован с пониженным риском развития ЮА у пациентов из Великобритании и Северной Америки. При анализе в подгруппах (согласно классификации ILAR) учеными было показано, что значимые различия сохранились только для пациентов с персистирующим и распространившимся олигоартритом, но не с РФ-негативным полиартритом, что согласуется с нашими результатами [4]. В то же время, при подразделении индивидов с учетом гендерных различий, Hinksc соавт. было установлено, что аллель G служил значимым протективным маркером только для девочек с ЮА, однако в отношении вариантов заболевания аналогичный анализ не проводился [4]. Кроме того, в репликативном исследовании Ellis с соавт. не было выявлено ассоциации изучаемого полиморфного локуса с развитием ЮА у детей из Австралии, хотя в отношении вариантов течения болезни и пола пациентовв указанной работе данные не приведены [3].
В целом, приведенные выше факты свидетельствуют в пользу подтверждения возможной роли полиморфного локуса rs2104286 гена IL2RA в формировании предрасположенности к аутоиммунной патологии, и в частности к ЮА. Однако, учитывая некоторую противоречивость в результатах ассоциативных исследований, необходимо дальнейшее изучение указанного полиморфного локуса при ЮА на выборках большего объема и, в особенности, при отдельных его вариантах, а также с учетом гендерных различий.
Заключение
В нашем исследовании установлена ассоциация полиморфного локуса rs2104286 гена IL2RA с развитиемРФ-негативного полиартрита у мальчиков из Республики Башкортостан. Показано, что маркерами повышенного риска данной формы ЮА у мальчиков служат аллель A и генотип AA, а пониженного - аллель G и генотип AG, при этом наиболее удачной моделью наследования является лог-аддитивная.
Рецензенты:
Хисамов Э.Н., д.б.н., профессор кафедры патологической физиологии, ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, г.Уфа;
Корытина Г.Ф., д.б.н., доцент, старший научный сотрудник лаборатории физиологической генетики ФГБУН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, г.Уфа.