Известно, что накопление свободных радикалов в организме человека приводит к возникновению множества патохимических процессов, в результате чего повреждаются стенки сосудов, липидные мембраны клеток, что приводит к таким серьезным патологическим изменениям, как сердечно-сосудистые и онкологические заболевания, а также преждевременное старение. Количество свободных радикалов (супероксидный анион-радикал, пероксид водорода, гидроксил радикал и др.) возрастает за счет снижения активности естественной антиоксидантной системы человека из-за воздействия таких факторов, как радиация, УФ облучение, курение, алкоголизм, постоянные стрессы, инфекционные болезни, некачественное питание. Вредное влияние на организм "свободных радикалов" можно уменьшить за счет систематического употребления некоторых лекарственных препаратов растительного происхождения, биологически активных добавок, содержащих флавоноиды, а также продуктов питания и напитков, обладающих высокой антиоксидантной активностью [1,3]. Основные природные антиоксиданты - витамины Е и С, полифенолы, флавоноиды, ароматические оксикислоты, антоцианы и др. Антиоксиданты защищают клеточные структуры от повреждающего действия свободных радикалов, а это предохраняет организм человека от болезней. Из всех групп природных соединений, применяемых в медицинской практике, особое место занимают флавоноиды, которые опосредованно через ферментные системы регулируют окислительно-восстановительные процессы, определяющие, в первую очередь, состояние клеточной мембраны [6].
Цель исследования
По данным литературы имеются сведения об антиоксидантной активности флавоноидов рода Tagetes [2].
Целью настоящего исследования является изучение антиоксидантной активности извлечения из цветков бархатцев распростертых (Tagetes Patula), полученное экстракцией сырья водой и этанолом различной концентрации.
Материалы и методы
Определение общего содержания антиоксидантов в различных извлечениях из цветков бархатцев распростертых проводили на жидкостном хроматографе «Цвет Яуза-01-АА»
Массовую концентрацию антиоксидантов измеряли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала от концентрации кверцетина и/или галловой кислоты.
Сущность амперометрического метода измерения массовой концентрации антиоксидантов заключается в измерении силы тока, возникающего при окислении молекул антиоксиданта на поверхности рабочего электрода при определенном потенциале, который после усиления преобразуется в цифровой сигнал. Величина, возникающей при этом силы электрического тока, будет зависеть как от природы и концентрации анализируемых веществ, так и от типа материала рабочего электрода и потенциала, приложенного к электроду[4].
Результаты работы и их обсуждение
Водно-спиртовые, спиртовые и водные извлечения антиоксидантов определяли исходя из площадей пиков дифференциальных кривых соответствующих экстрактов [6]. Площади пиков, а также концентрации антиоксидантов в пересчете на галловую кислоту и кверцетин представлены в таблице 1.
Таблица 1
Содержание антиоксидантов (в пересчете на кверцетин и галловую кислоту), полученных из цветков бархатцев распростертых:
|
Объект исследования: бархатцы распростертые |
Используемые экстрагенты |
Площадь пика (
|
Содержание антиоксидантов (в пересчете на кверцетин, мг/г) |
Содержание антиоксидантов (в пересчете на галловую кислоту, мг/г) |
|
цветки |
спирт этиловый 96% |
457,98 |
0,00675 |
0,005 |
|
цветки |
спирт этиловый 70% |
763,74 |
0,013 |
0,008 |
|
цветки |
спирт этиловый 40% |
1516,45 |
0,032 |
0,0205 |
|
цветки |
вода |
4168,79 |
0,0035 |
0,0022 |
)
0,004
Исходя из экспериментальных данных, представленных в таблице 1, можно сделать вывод о том, что максимальное содержание антиоксидантов выявлено в экстракте из цветков бархатцев распростертых, полученным 40% спиртом этиловым.
Методика выполнения измерений содержания антиоксидантов в напитках и пищевых продуктах, биологически активных добавках, экстрактах лекарственных растений амперометрическим методом, разработанная ОАО НПО «Химавтоматика», аттестована ФГУП Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы в соответствии с ГОСТ Р 8.563-96, ГОСТ Р ИСО 5725-2002 (свидетельство об аттестации МВИ № 31-07).
При соблюдении всех регламентированных условий и проведения анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений, не должны превышать значений, представленных в таблице 2.
Таблица 2
Метрологические характеристики, приведенные в аттестованной ФГУП ВНИИМС методике
|
Диапазон измерений массовой концентрации (массовой доли), мг/г (по кверцетину) |
Показатель точности (границы относительной погрешности) |
Показатель повторяемости (относительное средне-квадратическое отклонение повторяемости), σr,% |
Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), σR,% |
Предел повторяемости, r, %, P=0.95, n=2 |
|
От 0,2 до 4000 вкл. |
28 |
10 |
14 |
28 |
%, при Методика получения анализируемых извлечений: для приготовления экстрактов сырье предварительно измельчали. Точную навеску измельченного сырья (около 1г) помещали в колбу вместимостью 100 мл, добавляли примерно 30 мл спирта этилового соответствующей концентрации или воды и кипятили на водяной бане в течение 30 минут. Содержимое колбы фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Извлечение вышеуказанным способом повторяли еще 2 раза, фильтр промывали экстрагентом и доводили объем фильтрата до метки. В случае необходимости пробу разбавляли [5].
Перед выполнением каждого цикла анализируемых проб проводили контроль чистоты аналитической системы. Для этого после выхода прибора на рабочий режим в него в качестве пробы вводили элюент. Если дрейф фонового тока не превышает 5%, система считается чистой. Для каждой из проб проводили по пять последовательных измерений выходного сигнала (площади пика) анализируемого антиоксиданта. Массовую концентрацию антиоксидантов исследуемого образца, эквивалентную кверцетину, определяли по градуировочному графику кверцетина. При расчете результата учитывали разбавление пробы. Массовую концентрацию X, мг/г, определяли по формуле:
X=
где 
– массовая концентрация антиоксидантов, найденная по градуировочному графику, мг/л; 
- объем экстракта анализируемой пробы, мл; 
- навеска анализируемого вещества, г; N - кратность разбавления анализируемого образца.
Если выполняется условие приемлемости, за результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений:
где 
- результаты параллельных определений массовой концентрации (массовой доли) антиоксидантов, (мг/г); r – значение предела повторяемости, в данном случае равное 10.
Если условие, представленное выше не выполняется, то получают еще по два результата в полном соответствии с приведенной МВИ. Тогда за результат измерений принимают среднее арифметическое значение результатов четырех определений, если выполняется условие (8).
где
- максимальное и минимальное значения из полученных четырех результатов параллельных определений массовой концентрации (массовой доли) антиоксидантов, мг/г; 
- значение критического диапазона для уровня вероятности P=0,95 и n-результатов определений, равно:
= f(n)*σr,
где: f(n) – коэффициент критического диапазона, для n=4 равен 3,6
σr – относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости, равное в данном случае 10% (таблица 2).
Таким образом, условие примет для данного метода следующий вид:
36
Если данное условие не выполняется, выясняют причины превышения критического диапазона, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.
Результаты анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:
,
где 
– среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми по неравенствам (8) или (10); 
– границы относительной погрешности, %, (таблица 2).
Выводы
Установлено содержание антиоксидантов в спиртовых и водно-спиртовых, водных извлечениях цветков бархатцев распростертых. Извлечение, полученное экстракцией спиртом этиловым 40%, проявляет максимальную антиоксидантную активность. Эти данные явились обоснованием для выбора спирта этилового 40% в качестве оптимального экстрагента при получении биологически активной субстанции для последующих исследований.