Одним из неблагоприятных осложнений течения беременности является задержка внутриутробного развития плода (ЗВУР). Последнее время наблюдается тенденция к росту количества детей, рожденных с признаками ЗВУР. По данным ВОЗ число новорожденных с задержкой развития колеблется от 31,1 % в Центральной Азии до 6,5 % в развитых странах Европы.

Задержка внутриутробного развития плода является многодисциплинарной проблемой не только неонатологии, но и педиатрии в целом. В литературе имеется большое количество исследований, указывающих на то, что дети, рожденные с признаками задержки внутриутробного развития плода, значительно чаще отстают в физическом и психомоторном развитии, чем дети с нормальными антропометрическими данными. Кроме того, у них выше показатели заболеваемости и смертности.

Причины, приводящие к развитию задержки внутриутробного развития плода, многообразны. Принято различать три основные группы факторов риска: материнские, плацентарные, плодовые, а по другим данным четыре: материнские, плацентарные, социально-биологические и наследственные (генетические) [7].

Несмотря на активное изучение факторов, ассоциированных с формированием задержки внутриутробного развития плода, многие вопросы рассматриваются неоднозначно и остаются нерешенными. Это обусловлено полиэтиологичностью данного состояния, многочисленными сложными патогенетическими механизмами, лежащими в её основе [7]. Важную роль в этом отводят нарушениям метаболического, нутритивного статуса матери и будущего ребёнка, уровня обеспеченности их отдельными микро- и макроэлементами [3, 6].

Актуальность изучаемой проблемы обусловлена прежде всего тем, что восприимчивость к различным заболеваниям сердечно-сосудистой системы, аллергическим заболеваниям, патологии желудочно-кишечного тракта и другим социально-значимым болезням в будущем детерминируется не только взаимодействием между генами и окружающей средой, но и дополняется новыми данными о ключевой роли эпигенетического репрограммирования [8].

Открытые в последнее время важнейшие генетические факторы многих мультифакториальных состояний, таких как дефекты фолатного обмена, тромбофилия, нарушения системы детоксикации, иммунологическая несостоятельность, могут выступать в качестве ведущих причин тяжелой акушерской патологии, что ассоциируется с задержкой внутриутробного развития плода, тяжёлым гестозом, невынашиванием беременности.

При этом подчёркивается особая роль фолиевой кислоты, которая участвует в качестве кофактора в большом количестве клеточных реакций, в их дифференцировке, жизнеобеспечении [1, 2].

Ключевым ферментом фолатного цикла является метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR), который переводит фолиевую кислоту в ее активную форму 5-метилтетрагидрофолат.

В последние годы акушерскую патологию, включая задержку внутриутробного развития плода, привычные выкидыши, гестозы, преждевременную отслойку нормально расположенной плаценты, хроническую плацентарную недостаточность, связывают с мутацией гена фермента MTHFR.

Существует ряд аллельных вариантов этого гена, вызывающих тяжелую недостаточность фермента, но большинство из этих вариантов редки. Практическое значение имеют два полиморфизма: С677Т в экзоне 4 и А1298С в экзоне 7.

Установлена прямая связь полиморфизма 677Т гена MTHFR с уровнем гомоцистеина в крови, с его фетотоксическим, тератогенным эффектом [1], аллель 2757G гена метионинсинтазы ассоциируется с риском нарушения белкового обмена у плода, формированием различных хромосомных аномалий, полиморфизмы гена метионинсинтазы-редуктазы связаны с нарушением процесса метилирования ДНК и синтеза нуклеиновых кислот [5].

Таким образом, полиморфизм генов, ответственных за обмен фолиевой кислоты, может негативно сказываться на росте и делении клеток плода и плаценты. При сочетании неполноценных функционально ослабленных аллелей на фоне действия неблагоприятных (провоцирующих) факторов внешней среды такие полиморфизмы могут играть важную роль в патологии беременности и нарушении эмбрионального развития.

Несмотря на это, многие патогенетические аспекты ассоциации нарушений фолатного обмена и задержки внутриутробного развития плода изучены недостаточно. Поэтому дальнейшие исследования в этой области особенно актуальны.

Цель нашего исследования – установить дополнительные факторы риска развития нарушений фолатного обмена при различных формах задержки внутриутробного развития плода.

Материал и методы исследования

Диагноз задержки внутриутробного развития (ЗВУР) выставлен на основании общепринятых критериев диагностики, результатов анализа биофизического состояния плода в динамике прогрессирования беременности [9]. Учитывались следующие данные: рождение плода с массой менее 10-го процентиля, относительно показателей, характерных для данного гестационного срока; морфологический ин­декс зрелости, отстающий на 2 и более недель от истинного гестационного возраста [7].

При этом использовались данные ультразвукового исследования (УЗИ аппарат «Aloca 1700» с конвексным абдоминальным трансдьюсером (3,5 МГц), оснащённый акушерской программой): фетометрии; плацентографии с определением двигательной активности, тонуса плода, количества околоплодных вод. В неонатальном периоде всем детям была проведена соматометрия с использованием центильных таблиц физиологических параметров, имеющих градацию по периодам гестационного возраста [7]. Нами было обследовано 24 новорождённых ребенка со ЗВУР (основная группа). Гипопластический вариант (симметричный тип) ЗВУР был верифицирован у 8 детей, гипотрофический (асимметричный вариант) – у 16 новорождённых детей.

Всем обследованным новорожденным пациентам было проведено исследование генотипов фолатного цикла. Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов пуповинной крови стандартным методом при помощи протеиназы К с последующей фенольной экстракцией и осаждением этанолом. Анализ полиморфных вариантов специфических участков генома проводился с использованием методов полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов [4, 10]. Полученные данные сравнивали с аналогичными показателями здоровых новорожденных (контрольная группа), прошедших обследование в ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦСО РАМН г. Томск. В ходе работы были изучены полиморфные системы гена MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктаза): С677С, С677Т, Т677Т с интерпретацией частоты генотипов: С/С – нормальный вариант полиморфизма в гомозиготной форме, С/Т – гетерозиготная форма полиморфизма и Т/Т – мутантный вариант полиморфизма, связанный с увеличением риска заболевания; гена МТR (метионинсинтаза): А2756А, А2756G, G2756G (AA – нормальный вариант полиморфизма в гомозиготной форме, AG – гетерозиготная форма полиморфизма, GG – мутантный вариант полиморфизма, связанный с увеличением риска заболевания, в гомозиготной форме); гена MTRR (метионинсинтаза-редуктаза): G66G, G66А, А66А(GG – нормальный вариант полиморфизма в гомозиготной форме, AG – гетерозиготная форма полиморфизма, АА – мутантный вариант полиморфизма, связанный с увеличением риска заболевания, в гомозиготной форме). Оценку результатов и комплексный анализ полученных данных проводили методом вариационной статистики с вычислением средней арифметической (M) её ошибки (m), доверительного коэффициента Стьюдента (t) при заданном уровне значи­мости (p) и степени достоверности. Сравнительный анализ изучаемых показателей в разных группах проводился с использованием непараметрического метода Фишера. Статистическая обработка материала проводилась с помощью специализированных пакетов прикладных программ для исследований «Excel-2003» и «Statstica 6.0» for Windows. Различия для всех видов анализа считали статистически значимыми при p <0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

При проведении генетического исследования полиморфных систем генов фолатного цикла у новорожденных детей с различными типами ЗВУР были получены следующие результаты, представленные в таблице.

Ранжирование генотипов MTRу новорождённых основной группы показало, что частота генотипа А2756А существенно не отличалась от контрольных значений и составила 54,2 % относительно 58,3 % в контроле. Гетерозиготная форма полиморфизма А2756G с одинаковой частотой диагностировалась в обеих группах сравнения (37,5 % и 38,0 %, соответственно; p>0,05). Однако мутантный генотип полиморфизма MTRв гомозиготной форме (G2756G) в 2,2 раза чаще встречался у пациентов со ЗВУР относительно контрольной группы (8,3 % и 3,7 %, соответственно; p<0,05). При этом не была установлена достоверность различий частоты аллелей MTR в группах исследования. Аллель 2756А выявлена у 72,95 % больных детей (в контроле – 77,3 % пациентов), 2756G зарегистрирована у 27,05 % новорожденных по сравнению с контрольной группой, где 2756G определялась у 22,7 % обследованных пациентов.

Полученные данные свидетельствуют о наличии ассоциации полиморфизма MTRG2756G с частотой формирования задержки внутриутробного развития плода. Вероятно, это обусловлено многочисленными биохимическими эффектами на уровне клеток, межорганными взаимосвязями, детерминированными данным геном и усиливающимися при дефиците витамина B₁₂. В проведённых ранее исследованиях доказана ассоциация мутантного полиморфизма MTR с развитием внутриутробной гипоксии, хронической фетопланцентарной недостаточности, нарушением синтеза белка, нуклеиновых кислот. И в первую очередь это обусловлено нарушением метаболизма гомоцистеина с развитием системных проявлений тромбофилии [1,5].

В структуре полиморфизмов гена MTHFR доминировали дети с гетерозиготным генотипом изученного полиморфизма С677Т. Они составили 62,5 % среди обследованных новорождённых с ЗВУР (в контроле – 40,7 %; p<0,001). Нормальный вариант полиморфизма в гомозиготной форме С677С имели 25,0 % детей основной группы относительно контроля – 52,0 % (p<0,001). Мутантный вариант полиморфизма Т677Т был выявлен у 12,5 % пациентов (контроль – 7,3 %; p<0,05). Таким образом, было установлено, что при ЗВУР достоверно чаще, чем у здоровых новорождённых, регистрировались генотипы СТ, ТТ, но реже – СС. Частота аллелей гена MTHFR отличалась в группах пациентов. Новорождённые с задержкой физического развития в 1,3 раза реже имели аллель 677С, чем пациенты контрольной группы (56,25 % и 72,3 % обследованных пациентов, соответственно; p<0,01), но при задержке внутриутробного развития в 1,6 раза чаще выявляли мутацию 677Т (43,75 % и 27,7 % новорожденных, соответственно; p<0,01).

Вероятно, в основе отдельных причин развития ЗВУР лежат эпигенетические адаптивные изменения в процессе метилирования ДНК, нуклеиновых кислот, обусловленные нарушением фолатного цикла, нарушением белкового обмена [8]. Выявленная частота мутантных вариантов полиморфизма в гомозиготной форме, вероятно, свидетельствует о наличии у женщин, родивших детей со ЗВУР, генетически запрограммированных рисков неблагоприятного исхода беременности. С эти связаны риски преждевременных родов, хронической фетоплацентарной недостаточности, гипергомоцистеинемии, тромбофилии, хронической внутриутробной гипоксии плода, тяжёлого гестоза [1]. На внутриутробное развитие ребёнка влияет не только материнский, но и плодный генотип [9]. Всё вышесказанное является одной из многих причин, лежащих в основе патогенеза формирования ЗВУР.

В процессе анализа акушерского анамнеза женщин, родивших детей с ЗВУР, нами была установлена высокая распространённость среди них табакокурения (66,7 %). По отдельным данным [2] в III триместре беременности уровень гомоцистеина в крови у курящих женщин в 1,5 раза выше, чем у некурящих (р <0,005), уровень фолиевой кислоты в крови ниже в 3 раза (р р<0,005), а витамина B₁₂ – на 20 % (р <0,05). Однако ассоциация частоты полиморфизмов генов, ответственных за обмен фолиевой кислоты, с курением будущей матери чётко не установлена. Можно предположить, что высокий риск фетального табачного синдрома среди обследованных нами детей с задержкой внутриутробного развития, вероятно, ассоциирован с реализацией патологических процессов у генетически предрасположенных (наличие мутантных полиморфизмов) пациентов на фоне гиповитаминоза B₁₂ и пониженного уровня фолиевой кислоты.

Частота генотипов и аллелей генов фолатного цикла у новорожденных

При оценке влияния полиморфизма генов фолатного обмена на развитие вариантов задержки внутриутробного развития плода отмечена более высокая частота встречаемости полиморфизма С677Т гена MTHFR (52,4 %), A2756G гена MTR (28,6 %), А66А гена MTRR (30,0 %) у новорождённых с гипотрофическим вариантом задержки развития. Кроме того, полиморфный вариант С677Т гена MTHFR (42,6 %), A2756G гена MTR (23,8 %), А66А гена MTRR (35,0 %) чаще диагностировался у новорождённых мужского пола. Корреляционный анализ установил, что изучаемые полиморфизмы оказывают существенное влияние на частоту формирования задержки внутриутробного развития и степень ее тяжести. При этом были выявлены соответствующие корреляции относительно полиморфизма 677Т гена MTHFR (r +0,62; r + 0,54, p<0,05, соответственно); А66А гена MTRR (r +0,34; r +0,36, p<0,05).

В результате проведенного анализа была установлена ассоциация полиморфизмов Т677Т гена MTHFR, G2756G гена MTR и A66A гена MTRR с частотой формирования ЗВУР. Наше исследование показало, что данные генотипы чаще были зарегистрированы при гипотрофическом варианте течения ЗВУР, а также они чаще выявлялись у пациентов мужского пола.

Выводы

1. В результате проведенного исследования показано, что метаболические процессы, детерминированные генами фолатного обмена MTHFR и MTRR, играют важную роль в патогенезе формирования ЗВУР. По результатам нашего исследования установлена низкая сила детерминации для А66А гена MTRR, а также средняя сила для полиморфизма 677Т гена MTHFR.
2. Установлено, что задержка внутриутробного развития чаще всего формируется при наличии полиморфизмов аллельных генов С677Т у 62,5 % больных новорожденных и Т677Т гена MTHFR у 12,5 % наблюдавшихся пациентов, G2756G гена MTR у 8,3 % испытуемых новорожденных, A66A гена MTRR у 34,8 % родившихся младенцев.
3. Определение полиморфизмов С677Т гена MTHFR, A2756G гена MTR, А66А гена MTRR можно рассматривать в качестве объективного критерия риска формирования ЗВУР, для обоснования патогенетических подходов в проведении своевременных превентивных мероприятий.