В настоящее время большое внимание уделяется изучению роли оксида азота (NO) и возможности его использования. Он вырабатывается различными клетками организма и контролирует в них многие функции и биохимические процессы. Оксид азота вызывает релаксацию кровеносных сосудов и гладкомышечной ткани, обладает нейромодулирующей и противоопухолевой активностью, регулирует синтез и секрецию гормонов, активность тромбоцитов [1]. Снижение биодоступности и синтеза NO является ключевым звеном формирования эндотелиальной дисфункции [5; 6]. Это вызывает оправданное стремление использовать оксид азота в терапевтических целях при недостаточной выработке данного медиатора эндотелиальными клетками.
В Российском Федеральном ядерном центре – Всероссийском научно-исследователь-ском институте экспериментальной физики (ФГУП “РФЯЦ – ВНИИЭФ”, г. Саров) был разработан экспериментальный аппарат для синтеза газовой смеси оксида азота [4]. Возможный диапазон вырабатываемых им концентраций NO составляет от 20 до 200 ppm. Представляет интерес использование данного прибора в медицинской практике.
Следует отметить, что оксид азота является нестабильным соединением, которое существует несколько секунд. Он диффундирует в просвет сосуда, где быстро инактивируется растворенным кислородом, а также супероксидными анионами и гемоглобином [1]. Взаимодействие NO с супероксидом (и другими кислородными радикалами) приводит не только к утрате вазодилатирующего потенциала NO, но и к образованию высокотоксичного пероксинитрита. В случае массивного производства NO наблюдается повышенное образование пероксинитрита, которое сопровождается повреждением клеток путем их окисления или нитрозилирования [6]. Очевидно, что необходимо определить терапевтические дозы использования NO, а также изучить характер их воздействия на организм.
Целью исследования явилась оценка отдалённых результатов субхронического ингаляционно-наружного воздействия оксида азота (в дозе 50 ppm и 100 ppm) по биохимическим параметрам сыворотки крови у экспериментальных животных.
Материалы и методы
Выполнены две серии исследований на 28 крысах-самцах линии Wistar, в ходе которых животных разделили на 5 групп: первая состояла из интактных здоровых крыс (контроль), вторая и третья – были подвергнуты воздействию газообразного NO концентрацией по 50 ppm, четвёртая и пятая – по 100 ppm. Ингаляцию осуществляли ежедневно в течение 30 дней, продолжительность воздействия – 10 минут. Крыс первой серии (2 и 4 группы) выводили из эксперимента сразу же после окончания курса ингаляции оксида азота на 30-е сутки, животных второй серии (3 и 5 группы) – спустя 30 дней после проведённого курса, т.е. на 60-е сутки от начала эксперимента путем декапитации под комбинированным наркозом (золетил+ксила). Условия работы с животными соответствовали правилам Европейской Конвенции ET/S 129, 1986 и директивам 86/609 ESC.
Определение основных биохимических показателей сыворотки крови (глюкозы, общего билирубина, мочевины, мочевой кислоты, креатинина, общего белка, альбуминов, общего холестерола, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы) проводили на автоматическом анализаторе ILAB 650 (Италия, США, Япония).
Статистический анализ выполнен с применением программы Statistica 6 (StatSoft, Inc.). Количественные данные описаны с помощью медианы, первого и третьего квартилей Ме (Q1; Q3). Сравнение независимых переменных проведено по U-критерию Манна – Уитни. Результаты считались статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе исследования выявлено, что у крыс после ингаляции оксидом азота концентрация глюкозы в сыворотке крови была статистически достоверно выше, по сравнению с контрольной группой (табл. 1). С одной стороны, возможно, что оксид азота как внешний фактор может стимулировать в организме секрецию глюкокортикоидов, которые способствуют мобилизации энергетических ресурсов [5]. Они повышают уровень глюкозы в крови за счёт активации глюконеогенеза, содействуя толерантности организма к воздействию NO. С другой стороны, известно, что оксид азота замедляет распад глюкозы, ингибируя фосфофруктокиназу и глицеральдегидфосфатдегидрогеназу [12, 13]. Нельзя исключить цитотоксического воздействия активных форм оксида азота на собственные клетки и ткани организма. Известно, что b-клетки островков Лангерганса поджелудочной железы обладают слабой антиоксидантной активностью и поэтому наиболее подвержены деструктивному воздействию NO, дисфункция и деструкция которых способствует снижению выработки инсулина и повышению глюкозы в крови [2].
Таблица 1
Изменение биохимических показателей сыворотки крови при субхроническом воздействии оксида азота
|
Анализируемые показатели |
Группа 1 (контроль) n=8 |
Доза оксида азота 50 ppm
|
Доза оксида азота 100 ppm
|
||
|
Группа 2 (первая серия) n=5 |
Группа 3 (вторая серия) n=5 |
Группа 4 (первая серия) n=5 |
Группа 5 (вторая серия) n=5 |
||
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Глюкоза, ммоль/л |
13,3* 12,00 – 16,65** |
20,3 19,80 – 20,50 р1 = 0,012
|
18,4 18,10 – 18,90 р2 = 0,048 p5= 0,100 |
19,2 18,50 – 20,30 р3 = 0,024
|
19,0 18,30 – 19,20 р4 = 0,024 p6 = 0,400 |
|
Мочевина, ммоль/л |
5,05 4,05 – 5,85 |
6,50 5,00 – 7,20 р1 = 0,133
|
6,00 4,30 – 6,40 р2 = 0,376 p5= 0,400 |
5,20 5,20 – 5,70 р3 = 0,776
|
7,10 6,40 – 7,40 р4 = 0,012 p6 = 0,100 |
|
Мочевая кислота, мкмоль/л |
60,0 51,00 – 70,00 |
56,0 56,00 – 78,00 р1 = 0,667
|
41,0 36,00 – 42,00 р2 = 0,017 p5= 1,000 |
73,0 62,00 – 84,00 р3 = 0,117
|
40,0 35,00 – 40,00 р4 = 0,017 p6 = 0,400 |
|
Креатинин, мкмоль/л |
66,85 64,90 – 68,65 |
66,80 64,30 – 68,40 р1 = 0,921
|
68,1 67,40 – 68,80 р2 = 0,497 p5= 0,400 |
65,20 65,10 – 65,30 р3 = 0,279
|
66,3 62,10 – 75,20 р4 = 1,000 p6 = 0,700 |
|
Общий билирубин, мкмоль/л |
1,63 1,570 – 1,830 |
1,43 1,190 – 1,540 р1 = 0,167
|
1,40 1,370 – 1,500 р2 = 0,167 p5= 1,000 |
2,10 1,660 – 2,300 р3 = 0,167
|
1,41 1,150 – 1,580 р4 = 0,262 p6 = 1,000 |
|
Общий холестерол, ммоль/л |
1,55 1,350 – 1,700
|
1,70 1,400 – 2,000 р1 = 0,497
|
1,40 1,300 – 1,800 р2 = 0,776 p5= 0,400 |
1,70 1,300 – 2,100 р3 = 0,776
|
1,50 1,400 – 1,800 р4 = 0,921 p6 = 0,700 |
Примечание: n – количество наблюдений; * – медиана; ** – квартильный размах; р1 – достоверность различия анализируемых параметров в графе 1 и 2, р2 – в графе 1 и 3, р3 – в графе 1 и 4, р4 – в графе 1 и 5, р5 – в графе 2 и 3, р6 – в графе 4 и 5.
При глюконеогенезе в качестве источника энергии используются продукты белкового обмена. Установлено, что у крыс 2, 3 и 5 групп концентрация альбуминов статистически достоверно ниже, чем в контроле, что подтверждает активацию глюконеогенеза (табл. 2), т.к. альбумины являются резервным источником аминокислот в организме и при необходимости будут использоваться в первую очередь [9]. Выявлено, что у крыс первой серии эксперимента и группы 4 повышена активность аспартатаминотрансферазы (АСАТ), в то время как у аланинаминотрасферазы (АЛАТ) не подверглась статистически достоверному изменению по сравнению с интактной группой. Аспартатаминотрансфераза, по сравнению с АЛАТ, более интенсивно используется в синтезе глюкозы из белков. Этот фермент даёт возможность организму уйти от катаболизма углеводов, вернуться к анаболическим процессам, т.е. глюконеогенезу [8].
Таблица 2
Изменение показателей белкового обмена при субхроническом воздействии оксида азота
|
Анализируемые показатели |
Группа 1 (контроль) n=8 |
Доза оксида азота 50 ppm
|
Доза оксида азота 100 ppm
|
||
|
Группа 2 (первая серия) n=5 |
Группа 3 (вторая серия) n=5 |
Группа 4 (первая серия) n=5 |
Группа 5 (вторая серия) n=5 |
||
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Общий белок, г/л |
63,8* 61,10–68,55** |
58,0 57,70– 63,10 р1 = 0,133
|
57,9 56,40 – 58,70 р2 = 0,012 p5= 0,700 |
61,1 59,50 – 62,20 р3 = 0,194
|
55,8 55,10 – 56,60 р4 = 0,012 p6 = 0,200 |
|
Альбумины, г/л |
23,9 22,70 – 25,95 |
21,9 20,0 – 22,40 р1 = 0,048
|
20,7 18,70 – 22,70 р2 = 0,048 p5 = 1,000 |
24,1 20,70 – 24,90 р3 = 0,630
|
21,3 19,60 – 21,80 р4 = 0,024 p6 = 1,000 |
|
Глобулины, г/л |
39,8 37,30 – 43,60 |
37,7 35,60– 41,20 р1 = 0,497
|
37,2 33,70 – 39,90 р2 = 0,133 p5= 0,700 |
37,3 35,40 – 39,40 р3 = 0,279
|
35,3 34,00 – 35,50 р4 = 0,012 p6 = 0,700 |
|
Аспартатаминотрансфераза, ед./л |
157,1 121,9 – 169,8 |
278,3 212,5– 323,8 р1 = 0,017
|
217,2 180,9 – 228,6 р2 = 0,017 p5= 0,400 |
237,2 203,1 – 299,6 р3 = 0,017
|
166 147,9 – 438,2 р4 = 0,383 p6 = 0,700 |
|
Аланинамино- трансфераза, ед./л |
72,7 59,80 – 85,55 |
80,9 64,20– 121,90 р1 = 0,376
|
79,6 73,00 – 121,10 р2 = 0,279 p5= 1,000 |
70,7 68,60 – 187,50 р3 = 0,497
|
61,4 55,30 – 257,20 р4 = 0,921 p6 = 0,700 |
|
Щелочная фосфатаза, ед./л |
192 171,5 – 237,5 |
519 367,0– 544,0 р1 = 0,012
|
292 177,0 – 338,0 р2 = 0,279 p5= 0,100 |
535 436,0 – 555,0 р3 = 0,012
|
232 200,0 – 238,0 р4 = 0,376 p6 = 1,000 |
Примечание: n – количество наблюдений; * – медиана; ** – квартильный размах; р1 – достоверность различия анализируемых параметров в графе 1 и 2, р2 – в графе 1 и 3, р3 – в графе 1 и 4, р4 – в графе 1 и 5, р5 – в графе 2 и 3, р6 – в графе 4 и 5.
Известно, что адреналин участвует в формировании общего адаптационного синдрома, начиная с самого первого этапа воздействия возбуждающего агента [11]. Он способствует распаду гликогена в результате гликогенолиза с образованием гексозофосфатов в тканях. У крыс первой серии опытов наблюдается статистически достоверное повышение активности щелочной фосфатазы (ЩФ) по сравнению с контрольной группой. Щелочная фосфатаза является неспецифическим ферментом, который выпускает глюкозу из тканей путём отщепления фосфорнокислого остатка от гексозфосфатов. При повышении активности ЩФ происходит увеличение фосфатно-энергетического потенциала на уровне всего организма, так как образуется аденозинтрифосфат, т.е. реализуется закон сохранения энергии [8].
Длительное воздействие высоких концентраций глюкокортикоидов, превышающих адаптационные возможности организма, приводит к усиленному белковому катаболизму [9]. У крыс второй серии эксперимента содержание не только альбуминов, но и общего белка статистически достоверно ниже, чем в контрольной группе. С одной стороны, это может быть вызвано продолжительной активацией глюконеогенеза. С другой стороны, уменьшение концентрации общего белка и альбуминов может быть связано с печеночно-клеточной недостаточностью и снижением синтетической функции печени [3]. Известно, что эндогенный оксид азота подавляет синтез белка в печени [12]. Вероятно, что экзогенный NO обладает такими же свойствами. Следует отметить, что в группе 5, подвергнутой воздействию оксида азота концентрацией 100 ppm, наблюдается более глубокое нарушение белкового обмена, т.к., кроме изменения уровня общего белка и альбуминов, отмечено снижение концентрации глобулинов по сравнению с интактной группой, активности аспартатаминотрансферазы, а также высокая концентрация продукта конечного распада белка – мочевины [8]. Это указывает на повышенную потребность в возмещении больших энергетических затрат, связанную с дефицитом пластических ресурсов, а также на увеличение скорости катаболических реакций [9].
Установлено, что у крыс второй серии эксперимента снижена концентрация мочевой кислоты в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой. Данный результат может быть обусловлен несколькими причинами. Одна из них заключается в действии адренокортикотропного гормона, синтез которого увеличивается на широкий спектр внешних факторов, в том числе и на оксид азота. Адренокортикотропный гормон значительно повышает выделение с мочой продуктов белкового обмена, в частности мочевой кислоты [10]. Другая причина может быть обусловлена снижением синтеза ферментов, участвующих в образовании мочевой кислоты, протекающего в печени [7]. Известно, что гиперпродукция NO в организме приводит к нарушению перекисного окисления липидов, развитию и поддержанию патологических процессов, интоксикации организма [6]. Мочевая кислота выполняет функцию антиоксиданта. Вероятно, снижение её концентрации может указывать на активацию свободнорадикальных и катаболических процессов в организме экспериментальных животных второй серии эксперимента.
У крыс, ингалированных оксидом азота, не было выявлено статистически значимых отличий в показателях общего билирубина, креатинина, общего холестерола и активности аланинаминотрансферазы по сравнению со значениями интактной группы. Следует отметить, что в первой серии эксперимента концентрация общего белка, мочевины, мочевой кислоты в сыворотке крови также практически не отличались от значений контрольной группы. Между двумя сериями эксперимента статистически достоверных изменений по анализируемым показателям сыворотки крови не обнаружено.
Заключение
Таким образом, в первой серии эксперимента установлена мобилизация энергетических ресурсов организма в результате активации процессов глюконеогенеза и гликогенолиза, о чём свидетельствует повышение концентрации глюкозы, активности аспартатаминотрансферазы и щелочной фосфатазы, а также снижение содержания альбуминов в сыворотке крови экспериментальных животных. Кроме того, нельзя исключить вероятность деструктивного воздействия NO в исследованных дозах на b-клетки островков Лангенгарса поджелудочной железы, дисфункция которых могла привести к повышению уровня глюкозы в крови.
При оценке отдаленных результатов воздействия газообразного NO (вторая серия эксперимента) не отмечен возврат биохимических показателей сыворотки крови к исходным данным интактных животных. Наблюдаются нарушения белкового и углеводного обмена, которые указывают на истощение адаптационных возможностей организма. Субхроническое ингаляционно-наружное воздействие оксида азота с концентрациями 50 и 100 ppm способствует формированию биорадикального стресса, снижению процессов синтеза и увеличению скорости катаболических реакций, которые особенно ярко выражены при высокой дозе NO (100 ppm). Эти процессы могут привести к дезорганизации систем организма, патологическим состояниям, сопровождающимся структурными изменениями в тканях и органах. Необходимо дальнейшее исследование токсикологического воздействия ингаляционного оксида азота более низкого диапазона концентраций и доз.