Ожоги представляют глобальную медико-социальную проблему. По оценкам ВОЗ, в мире ежегодно страдают от ожогов различной степени тяжести более 6,6 млн человек. На долю термической травмы приходится большая часть ожогов: воздействие огнем 55 %, горячей водой 40 %. В России ежегодно регистрируется более 400 тысяч случаев смерти от ожогов. Высокая летальность обусловлена сложностью и многообразием патогенетических механизмов, лежащих в основе развития, течения и исхода термической травмы [10]. Центральную роль в патогенезе термической травмы занимает развитие системного воспалительного ответа на повреждение, вторичного иммунодефицита за счет гибели иммунокомпетентных клеток путем некроза и/или апоптоза. Это приводит к риску развития инфекционных осложнений, полиорганной недостаточности и в тяжелых случаях – к смерти. Поэтому актуальным является поиск новых средств и иммунокоррегирующих подходов для терапии ТТ. В последнее время интерес многих ученых направлен на изучение регуляторов гомеостаза эндогенной природы [1-3]. В частности, ранее нами в клинических и в экспериментальных условиях при различной патологии продемонстрированы протекторные свойства эритропоэтина (ЭПО), в том числе в связи с иммуномодулирующим действием [4-9]. Полагаем, что ЭПО может оказывать иммунотропные эффекты при ТТ за счет изменения гибели лимфоцитов в периферической крови. Цель работы – исследовать некоторые механизмы влияния эритропоэтина на популяционный спектр лимфоцитов в крови при экспериментальной термической травме.
Материалы и методы исследования. Эксперимент выполнен на 90 белых нелинейных половозрелых крысах массой 250±20 г. при строгом соблюдении требований Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. Все животные случайным образом были разделены на 3 группы: 1 группа – интактные (n=10), 2 группа – крысы с ТТ (n=40), 3 группа – крысы с ТТ, которым внутрибрюшинно вводили ЭПО (n=40). ТТ IIIА степени и площадью 4 % моделировали путем погружения участка межлопаточной области крысы в очищенную воду с температурой 98–99 оС на 12 с. Глубину ожога верифицировали при гистологическом исследования микропрепаратов кожи на микроскопе «Leika DMRXA» (Германия) с помощью компьютерной программы анализа изображений «ImageScope M» (Россия, Москва). ЭПО («Эпостим», международное непатентованное название: эпоэтин бета, ООО «Фармапарк», Россия) вводили в дозе 500 МЕ/кг ежедневно, суммарная доза введенного ЭПО на конец исследования составила 4000 МЕ/кг. Во 2 и 3 группах ежедневно проводили перевязки с наложением асептической повязки на область ожоговой раны. Кровь получали пункцией левого желудочка сердца под внутривенным наркозом «Золетилом» (тилетамин и золазепам, «ВирбакСантеАнималь», Франция). Исследования проводили на 3 и 8 сутки. Лимфоциты из периферической крови выделяли общепринятым методом на градиенте плотности фиколл-верографина 1,077. Определение популяционного спектра лимфоцитов периферической крови (СD3+, СD45+) осуществляли с помощью проточного цитофлуориметра «Navios» («BeckmanCoulter», США) с использованием специфических крысиных моноклональных антител производителя «ELISAKit» (Китай). Апоптоз лимфоцитов оценивали при окрашивании клеток конъюгированным с флюорохромоманнексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD) из набора «Annexin 5 – FITC/7-AADkit» («BeckmanCoulter», США) на проточном цитофлуориметре. Дифференцировали интактные клетки (Annexin-5-FITC–/7-AAD–), клетки с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD–), клетки с поздними признаками апоптоза и частично некротические клетки (Annexin-5-FITC+/7-AAD+). Результат выражали в %. Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в гептановой (г) и в изопропанольной (и) фазах липидного экстракта лимфоцитов по методу Волчегорского И. А. и соавт. Результаты выражали в единицах индексов окисления (е.и.о.): Е232/Е220 (первичные продукты ПОЛ – диеновые конъюгаты), Е278/Е220 (вторичные продукты ПОЛ – кетодиены и сопряженные триены) и Е400/Е220 (конечные продукты ПОЛ – Шиффовы основания). Результаты обрабатывали с использованием программы «Statistica 10.0 for Windows». Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием критериев Манна – Уитни, Вальда – Вольфовитца, Крускела – Уоллиса.
Результаты исследования и их обсуждение. Установлено, что при ТТ на 3 сутки эксперимента при исследовании популяционного спектра лимфоцитов крови содержание CD3+ лимфоцитов статистически значимо не изменяется, на 8 сутки наблюдается значимое почти двукратное снижение количества CD3+ клеток в крови (таблица 1).
Таблица 1
Влияние эритропоэтина на количественный состав лимфоцитов в периферической крови при термической травме (M±m)
|
Показатели |
Группа 1 Интактные (n=10) |
Группа 2а ТТ 3 сутки (n=10) |
Группа 3а ТТ+ЭПО 3 сутки (n=10) |
Группа 2b ТТ 8 сутки (n=10) |
Группа 3b ТТ+ЭПО 8 сутки (n=10) |
|
CD3+, 109/л |
3,14±0,12
|
2,94±0,31
|
4,10±0,56 р2a-3a<0,01 |
1,62±0,38 р1-2b<0,01 |
8,50±1,84 р2b-3b<0,01 р1-3b<0,01 |
|
CD45RA+, 109/л |
2,22±0,14
|
1,54±0,27 р1-2а<0,01 |
2,51±0,35 р2a-3a<0,01 |
0,90±0,07 р1-2b<0,01 |
5,34±0,92 р2b-3b<0,01 р1-3b<0,01 |
Примечание. Здесь и далее р – показатель значимости различий между группами по критериям Манна – Уитни, Вальда – Вольфовитца, Крускела – Уоллиса.
Количество CD45RA+ лимфоцитов снижается на 3 и 8 сутки ТТ. Полученные данные позволяют констатировать снижение представительства в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы Т-лимфоцитов (CD3+) и преимущественно В-лимфоцитов (CD45RA+).
При исследовании гибели лимфоцитов в периферической крови путем апоптоза и некроза при ТТ выявлено, что количество клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD-) прогрессивно увеличивается на 3 и 8 сутки эксперимента, так как количество лимфоцитов с данным фенотипом на 8 сутки значимо больше количества на 3 сутки ТТ (таблица 2). Содержание лимфоцитов с поздними признаками апоптоза, признаками некроза (Annexin-5-FITC+/7-AAD+) также прогрессивно увеличивается на 3 и 8 сутки эксперимента относительно группы интактных животных. Как следствие, количество интактных лимфоцитов прогрессивно снижается от 3 к 8 суткам ТТ.
Содержание при ТТ продуктов ПОЛ в липидном экстракте лимфоцитов периферической крови в гептановой фазе, которая концентрирует основную часть триацилглицеридов (резервных липидов), и в изопропанольной фазе, содержащей мембранные фосфолипиды, представлено в таблице 3. Как видно, на 3 сутки эксперимента возрастает количество диеновых конъюгатов, кетодиентов и сопряженных триенов в гептановой фазе и оснований Шиффа в изопропанольной фазе липидного экстракта лимфоцитов. К 8 суткам ТТ в гептановой фазе сохраняется повышенным содержание диеновых конъюгатов в гептановой фазе и оснований Шиффа в изопропанольной фазе. Кроме этого, на 8 сутки ТТ увеличивается содержание оснований Шиффа в гептановой фазе и кетодиентов и сопряженных триенов в изопропанольной фазе липидного экстракта лимфоцитов.
Полагаем, что окислительный стресс при ТТ, инициирующим звеном которого в периферической крови выступают активированные фагоциты, эндотелиоциты, тромбоциты, приводит к активации процессов пероксидации липидов мембран клеток крови, в том числе лимфоцитов, следствием чего является накопление продуктов ПОЛ в лимфоцитах периферической крови. Повреждение цитоплазматической мембраны и мембран органелл лимфоцитов запускает процесс гибели лимфоцитов в периферической крови путем некроза и/или апоптоза и приводит к снижению представительства Т-лимфоцитов (CD3+) и преимущественно В-лимфоцитов (CD45RA+). Таким образом, одним из звеньев патогенеза вторичного иммунодефицита при ТТ выступает лимфоцитопения, развивающаяся вследствие гибели лимфоцитов периферической крови, инициированной окислительным стрессом.
Применение ЭПО при ТТ приводит к восстановлению количества CD3+ и CD45RA+ лимфоцитов в периферической крови на 3 сутки эксперимента (таблица 1). На 8 сутки ТТ количество и CD3+, и CD45RA+ лимфоцитов в периферической крови становится более чем в 2 раза выше, чем в группе интактных животных.
Исследование интенсивности гибели лимфоцитов в крови при ТТ в условиях введения ЭПО показало, что на 3 сутки количество интактных клеток, клеток с ранними признаками апоптоза, с поздними признаками апоптоза, признаками некроза статистически значимо не отличается от группы сравнения (таблица 2). Отметим, что при сравнении с группой интактных животных на 3 сутки ТТ было увеличено только количество лимфоцитов с поздними признаками апоптоза, признаками некроза. На 8 сутки ТТ применение ЭПО приводит к снижению количества клеток с ранними признаками апоптоза, с поздними признаками апоптоза, признаками некроза до значений в группе интаткных животных. Как следствие, наблюдается увеличение количества интактных клеток.
Таблица 2
Влияние эритропоэтина на показатели гибели лимфоцитов периферической крови при термической травме (M±m)
|
Показатели |
Группа 1 Интактные (n=10) |
Группа 2а ТТ 3 сутки (n=10) |
Группа 3а ТТ+ЭПО 3 сутки (n=10) |
Группа 2b ТТ 8 сутки (n=10) |
Группа 3b ТТ+ЭПО 8 сутки (n=10) |
|
Annexin-5-FITC-/7-AAD-, % клеток |
93,16±0,16 |
88,38±2,26 р1-2а<0,01 |
91,62±1,85 |
66,56±5,60 р1-2b<0,01 р2a-2b<0,01 |
91,94±0,80 р2b-3b<0,01
|
|
Annexin-5-FITC+/7-AAD-, % клеток |
6,66±0,79 |
10,74±2,07 р1-2а<0,01 |
7,69±1,59 |
22,26±1,89 р1-2b<0,01 р2a-2b<0,01 |
7,90±0,77 р2b-3b<0,01
|
|
Annexin-5-FITC+/7-AAD+, % клеток |
0,16±0,04 |
0,82±0,17 р1-2а<0,01 |
0,62±0,28 р1-3a<0,01
|
10,70±3,90 р1-2b<0,01 р2a-2b<0,01 |
0,14±0,05 р2b-3b<0,01
|
Применение ЭПО при ТТ приводит на 3 сутки наблюдения к снижению содержания диеновых конъюгатов в гептановой фазе липидного экстракта лимфоцитов периферической крови, количество других продуктов ПОЛ значимо не отличается от группы животных с ТТ (таблица 3). На 8 сутки эксперимента в условиях применения ЭПО в гептановой фазе липидного экстракта лимфоцитов периферической крови снижается содержание диеновых конъюгатов и оснований Шиффа, в изопропанольной фазе снижается содержание кетодиентов и сопряженных триенов, а также оснований Шиффа.
Таблица 3
Влияние эритропоэтина на содержание продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта лимфоцитов периферической крови при термической травме (M±m)
|
Показатели |
Группа 1 Интактные (n=10) |
Группа 2а ТТ 3 сутки (n=10) |
Группа 3а ТТ+ЭПО 3 сутки (n=10) |
Группа 2b ТТ 8 сутки (n=10) |
Группа 3b ТТ+ЭПО 8 сутки (n=10) |
|
ДК (г), е.и.о. |
0,25±0,03 |
0,77±0,03 р1-2а<0,01
|
0,35±0,07 р2a-3a<0,01 |
0,77±0,10 р1-2b<0,01 |
0,40±0,07 р2b-3b<0,01 |
|
КД и СТ (г), е.и.о. |
0,204±0,011 |
0,32±0,03 р1-2а<0,01 |
0,31±0,08 |
0,19±0,07 |
0,106±0,060 р2b-3b<0,01 |
|
ШО (г), е.и.о. |
0,017±0,005 |
0,150±0,047
|
0,035±0,013 |
0,162±0,049 р1-2b<0,01 |
0,026±0,009 р2b-3b<0,01 |
|
ДК (и), е.и.о. |
0,86±0,24 |
1,03±0,05
|
0,96±0,09 |
0,97±0,15 |
1,13±0,04 |
|
КД и СТ (и), е.и.о. |
0,12±0,03 |
0,13±0,03 |
0,14±0,02 |
0,17±0,01 |
0,11±0,01 р2b-3b<0,01 |
|
ШО (и), е.и.о. |
0,035±0,010 |
0,070±0,019 р1-2а<0,01
|
0,114±0,057 |
0,052±0,019 р1-2b<0,01 |
0,018±0,007 р2b-3b<0,01 |
Примечание. Содержание продуктов ПОЛ в гептановой (г) и в изопропанольной (и) фазах липидного экстракта лимфоцитов.
Таким образом, нами при ТТ зафиксирован ПОЛ-ограничивающий эффект ЭПО в лимфоцитах периферической крови. Ограничение повреждения клеток свободными радикалами приводит к уменьшению их гибели путем апоптоза или некроза и, как следствие, восстановлению количественного представительства в кровотоке. Однако, учитывая установленный раннее факт значительного увеличения количества Т- и В-лимфоцитов в крови на 8 сутки ТТ в условиях применения ЭПО, может предположить стимулирующий эффект ЭПО в отношении пролиферации и дифференцировки клеток в ходе лимфопоэза в костном мозге, других органах иммунной системы.
Цитопротекторное действие ЭПО может реализоваться как напрямую, так и опосредованно за счет воздействия на ферменты антиоксидантной защиты, способствующих снижению количества активных форм кислорода. Ранее нами было установлено, что ЭПО повышает активность ферментов антиокислительной защиты в эритроцитах [5, 8]. По данным некоторых авторов, при связывании ЭПО с специфическими рецепторами на цитоплазматической мембране запускаются сигнальные пути, в том числе при участии активаторов транскрипции (STAT-5, STAT-3), которые приводят к активации генов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку клеток.
Выводы
- Установлено, что при экспериментальной термической травме на 3 и 8 сутки наблюдения происходит снижение количества CD3+ и CD45RA+ лимфоцитов в периферической крови, увеличивается количество лимфоцитов в крови с ранними признаками апоптоза, поздними признаками апоптоза, признаками некроза. При ТТ происходит накопление первичных продуктов перекисного окисления липидов в гептановой фазе, вторичных и конечных продуктов перекисного окисления липидов в гептановой и в изопропанольной фазах липидного экстракта лимфоцитов периферической крови.
- Применение при термической травмеэритропоэтина в дозе 500 МЕ/кг ежедневно приводит к восстановлению на 3 сутки и увеличению на 8 сутки количества CD3+ и CD45RA+ лимфоцитов в периферической крови, снижению на 8 сутки количества лимфоцитов в крови с ранними признаками апоптоза, поздними признаками апоптоза, признаками некроза. Применение ЭПО при ТТ оказывает ПОЛ-ограничивающий эффект в гептановой и в изопропанольной фазах липидного экстракта лимфоцитов периферической крови.