В последнее время в работах как отечественных, так и зарубежных ученых все более пристальное внимание стало уделяться нарушениям мозгового кровообращения (НМК) ишемического генеза. По всей видимости, это связано с высокой частотой развития данных патологий, а также с повышенным риском летального исхода и первичной инвалидизации. Кроме того, ишемические повреждения головного мозга имеют тенденцию к «омоложению» [4-6,16]. Все это делает НМК объектом пристального изучения фармакологов и клиницистов.
Повреждение головного мозга при его ишемии носит, как правило, многофакторный характер. Сюда можно отнести и снижение биоэнергетики головного мозга, развитие ацидоза, нарушение функции эксайтотоксических медиаторов, оксидативный стресс, гиперкоагуляцию, тромбообразование, воспаление и т.д. [12].
Многими авторами выделяется также и эдотелиальная дисфункция как одно из возможных патогенетических звеньев в развитии ишемии головного мозга [10,11]. Известно, что сосудистый эндотелий посредством секреции биологически активных веществ способен регуляторно воздействовать на процессы адгезии и агрегации тромбоцитов, про- и антикоагулянтное равновесие (антитромботическая функция эндотелия). При нарушении нормального функционального состояния сосудистого эндотелия происходит сдвиг в системе анти/проагреганты в сторону последних, что может повысить риск тромбообразования и усугубить течение заболевания [10,11,13]. Напротив, сохранение состояния сосудистого эндотелия в его физиологическом состоянии способно снизить число неблагоприятных последствий как в ишемическом, так и в постишемическом периоде [1]. Таким образом, актуальной становится проблема целенаправленного поиска биологически активных соединений, способных нормализовать функцию эндотелия мозговых сосудов на фоне его ишемии.
Целью данного исследования явилась сравнительная оценка действия мексидола, тиоктовой кислоты и ATACL на антитромботическую функцию эндотелия и некоторые показатели состава периферической крови экспериментальных животных на фоне фокальной ишемии головного мозга.
Материалы и методы. Данное исследование выполнено на 50 крысах-самцах линии Wistar массой 220-240 г, разделенных на 5 равных экспериментальных групп по 10 особей в каждой. Первую экспериментальную группу составили ложнооперированные животные. У четырех оставшихся групп животных воспроизводили ишемическое повреждение головного мозга (ГМ). Ишемию ГМ моделировали правосторонней окклюзией средней мозговой артерии (СМА) путем ее коагуляции под местом пересечения СМА с обонятельным трактом [1]. Исследуемые соединения вводились per os непосредственно после оперативного вмешательства и на протяжении 3 дней ишемического периода в дозах: мексидол («Фармасофт», Россия) – 30 мг/кг, тиоктовая кислота (октолипен, «Фармстандарт – Лексредства», Россия) – 50 мг/кг, ATACL - 100 мг/кг [7,8]. Группа крыс негативного контроля (НК, ОСМА) получала 0,9%-ный раствор хлористого натрия в эквиобъемном количестве. По истечении указанного временного периода проводили оценку состояния тромбоцитарного звена гемостаза, регистрацию процесса свертывания и некоторые показатели состава периферической крови.
Влияние исследуемых соединений на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз оценивали регистрацией параметров процесса АДФ-индуцированной (5 мкМ) агрегации тромбоцитов. При этом определяли степень, скорость и показатель агрегации тромбоцитов. Процесс агрегации тромбоцитов регистрировали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации АЛАТ – 2 «БИОЛА» (НПФ «БИОЛА», Россия) методом определения относительного среднего размера агрегатов [2]. Также определяли уровень первичного предиктора нарушения нормального функционирования антитромботического потенциала сосудистого эндотелия - фактора фон Виллебранда, агглютинационным методом, с использованием реактивов НПО «РЕНАМ». Исследование процесса свертываемости крови проводили на коагулографе Н-334. По полученным коагулограммам определяли продолжительность процесса свертывания крови в секундах. Гематологические показатели (количество лейкоцитов - WBC, лейкоформула (Lymph#, Mon#, Gran#), количество эритроцитов – RBC, содержание гемоглобина – HGB, гематокрит – HCT, средний объем эритроцита – MCH, концентрация гемоглобина в одном эритроците – MCHC, содержание тромбоцитов – PLT) определяли на автоматическом гематологическом анализаторе ветеринарного использования BC 2800vet (Mindray).
Результаты опытов обрабатывали методом вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., США для операционной системы Windows). Вычисляли среднее значение и стандартную ошибку среднего значения (M±m). Полученные данные проверяли на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро - Уилка. В случае нормального распределения данных для сравнения средних использовали t-критерий Стьюдента. При ненормальном распределении результатов эксперимента дальнейшую статистическую обработку данных проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни.
Результаты и их обсуждение
У ложнооперированных животных степень агрегации тромбоцитов составляла 1,463±0,127 у.е. (рис. 1). В результате правосторонней окклюзии средней мозговой артерии у группы НК данный показатель увеличился на 97,9% (p<0,05). Применение мексидола и тиоктовой кислоты привело к снижению степени агрегации, относительно группы крыс негативного контроля, в 1,6 и 1,44 раза, тогда как на фоне введения ATACL данный параметр процесса агрегации тромбоцитов снизился, по сравнению с группой животных негативного контроля, в 1,74 (p<0,05) раза.
Рис. 1. Влияние исследуемых соединений на параметры процесса агрегации тромбоцитов: * - достоверно, относительно группы Л/О (p<0,05),
# - достоверно, относительно группы НК (p<0,05)
Аналогичная тенденция наблюдалась и при анализе скорости агрегации тромбоцитов. У крыс группы негативного контроля данный показатель составлял 3,806±0,694 у.е., в то время как у ложнооперированных животных значение скорости агрегации было 1,159±0,236 у.е. Таким образом, скорость агрегации при фокальной ишемии головного мозга возрастает в 3,3 раза (p<0,05) по сравнению с Л/О крысами. Из изучаемых соединений наиболее выраженное влияние на скорость агрегации тромбоцитов оказал мексидол (относительно группы животных негативного контроля данный показатель уменьшился на 147,9% (p<0,05)). Тиоктовая кислота и ATACL также способствовали снижению скорости агрегации, однако изменения (снижение относительно НК группы) данного параметра процесса агрегации были меньше, чем при применении мексидола, и составили 104,7% и 98% (p<0,05) соответственно. Следует также отметить следующее: у группы НК показатель агрегации тромбоцитов, по сравнению с ложнооперированными крысами, несколько увеличился, а именно на 6,6%, и при применении исследуемых соединений практически не претерпел существенных изменений (рис. 1).
При оценке влияния исследуемых соединений на уровень фактора фон Виллебранда (FW) установлено, что у группы НК данный показатель увеличился, по сравнению с Л/О группой, на 42,4% (p<0,001): с 82,6 до 117.8 у.е. В то же время пероральное введение мексидола и ATACL способствовало снижению уровня FW на 10 и 15% (p<0,02) соответственно. На фоне приема тиоктовой кислоты уровень фактора фон Виллебранда практически не отличался от такового у группы крыс негативного контроля (рис. 2).
Рис. 2. Влияние исследуемых соединений на уровень фактора фон Виллебранда:
* - достоверно, относительно группы Л/О (p<0,001),
# - достоверно, относительно группы НК (p<0,02)
В результате анализа продолжительности свертывания крови установлено, что у группы Л/О она составляла 109,7±9,195 сек. У группы ОСМА данный показатель уменьшился в 1,52 (p<0,02) раза. Применение мексидола и тиоктовой кислоты значимого влияния на процесс свертывания крови не оказало, и как результат данный показатель практически не отличался от значения группы НК. Пероральное введение ATACL оказало положительное влияние на продолжительность свертывания крови, что отразилось в увеличении данного показателя на 32,9 сек (относительно группы НК) до значения 105±12,349 сек, т.о., при приеме 4-гидрокси-3,5-дитретбутил коричной кислоты продолжительность свертывания крови практически достигла значения ложнооперированной группы крыс.
Рассматривая некоторые показатели состава периферической крови экспериментальных животных, следует отметить повышение содержания лейкоцитов у группы крыс негативного контроля на 35,1% (p<0,05) по сравнению с Л/О группой животных. При этом наблюдалось значительное увеличение отдельных фракций лейкоцитов: содержание лимфоцитов - на 32,6% (p<0,05), гранулоцитов – на 41,7%, моноцитов – на 23,1% (таблица). Также у группы НК относительно ложнооперированных крыс отмечено снижение гемоглобина на 8,5% (p<0,05) [3]. Остальные анализируемые показатели состава периферической крови экспериментальных животных существенных изменений не претерпели.
На фоне приема исследуемых соединений как общий уровень лейкоцитов, так и уровень их отдельных фракций существенно снизился (по сравнению с НК группой). При введении мескидола и тиоктовой кислоты содержание лейкоцитов снизилось на 62,2% и 35,4%, по сравнению с группой крыс негативного контроля, в то время как введение ATACL способствовало снижению данного показателя на 61,3%. Кроме того, применение ATACL нормализовало содержание гемоглобина (статистически значимых отличий между группами животных, получавших ATACL, и ложнооперированными крысами не наблюдалось), в то время как при применении мексидола и тиоктовой кислоты, относительно Л/О животных, данный показатель существенно снизился (таблица). Также необходимо отметить снижение количества тромбоцитов при пероральном введении мексидола и тиоктовой кислоты на 15,9 и 16% соответственно (относительно Л/О группы крыс), чего не наблюдалось при применении 4-гидрокси-3,5-дитретбутил коричной кислоты.
Изменение состава периферической крови на фоне фокальной ишемии ГМ и при применении исследуемых соединений
Примечание: * - достоверно относительно группы Л/О (p<0,05).
|
Группа |
WBC, 109кл/л |
Lymph# |
Mon# |
Gran# |
RBC 1012 кл/л |
HGB, г/л |
HCT |
MCV, fl |
MCH, pg |
MCHC, г/л |
PLT, 109кл/л |
|
|
Л/О |
M |
8,26 |
5,46 |
0,26 |
2,54 |
5,9472 |
151,8 |
32,02 |
53,94 |
26,08 |
486 |
496,6 |
|
m |
1,325 |
1,192 |
0,05 |
0,284 |
0,416 |
7,453 |
2,29 |
0,482 |
2,563 |
51,355 |
25,88 |
|
|
НК |
M |
11,16* |
7,24* |
0,32 |
3,6 |
6,136 |
139,8* |
34,14 |
55,76 |
23,1 |
415,8 |
498,8 |
|
m |
1,178 |
1,104 |
0,06 |
0,197 |
0,522 |
4,8 |
2,859 |
0,631 |
1,154 |
20,519 |
55,06 |
|
|
ATACL |
M |
6,92 |
3,98 |
0,22 |
2,72 |
6,134 |
157,6 |
33,74 |
55,06 |
25,86 |
471,4 |
503,8 |
|
m |
0,817 |
0,719 |
0,037 |
0,315 |
0,281 |
2,135 |
1,671 |
0,444 |
1,272 |
25,927 |
22,35 |
|
|
Мексидол |
M |
6,88 |
4,7 |
0,18 |
2 |
5,528 |
139,6 |
29,66 |
53,8 |
25,74 |
479,8 |
428,2 |
|
m |
0,959 |
0,641 |
0,049 |
0,318 |
0,376 |
4,925 |
2,026 |
0,593 |
2,255 |
41,015 |
44,99 |
|
|
Тиоктовая кислота |
M |
8,24 |
4,7 |
0,32 |
3,22 |
4,872 |
139,2 |
27,04 |
55,8 |
28,84 |
516,6 |
428 |
|
m |
0,928 |
0,652 |
0,06 |
0,38 |
0,32 |
5,601 |
1,442 |
1,241 |
1,611 |
18,338 |
35,012 |
|
Подобные изменения, наблюдаемые при фокальной ишемии головного мозга, вероятно, связаны со сниженной продукцией сосудистым эндотелием антиагрегантных факторов, в частности простациклина, снижением биодоступности эндогенного оксида азота, повышенным выбросом тромбоксана А2 и тканевого тромбопластина, повышается также уровень FW, в результате чего происходит активация тромбоцитов, что влечет за собой повышение тромбогенного потенциала крови и, как следствие, может привести к развитию синдрома гиперкоагуляции. Повышение количества лейкоцитов в периферической крови, по всей видимости, связано с развитием воспалительной реакции с повышенной продукцией провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8) [9,12].
Исследуемые соединения: мексидол, тиоктовая кислота и ATACL, по всей видимости, способны в условиях ишемии ГМ снижать биодеградацию оксида азота и повышать экспрессию эндотелиальной изоформы NO-синтазы; также, вероятно, имеет место снижение неблагоприятных отсроченных эффектов iNOS за счет инактивации образующегося пероксонитрита [7,8,14,15]. В результате может происходит нормализация функционального состояния эндотелиоцитов мозговых сосудов с восстановлением продукции эндотелиальных антитромбогенных факторов и снижением выброса проагрегантных соединений, что предполагает наличие у изучаемых веществ эндотелиопротекторной активности.
Выводы:
1. Правосторонняя окклюзия средней мозговой артерии приводит к нарушению антитромботической функции эндотелия мозговых сосудов, сопровождаемому повышением степени (в 3,3 раза (p<0,05) по сравнению с Л/О крысами), скорости и показателя агрегации тромбоцитов, уровня фактора фон Виллебранда (на 42,4% (p<0,001)), продолжительности свертывания крови, содержанием гемоглобина и умеренным лейкоцитозом.
2. Применение исследуемых соединений способствовало нормализации антитромботической функции эндотелия и состава периферической крови. При этом наиболее выраженный эффект наблюдается на фоне введения 4-гидрокси-3,5-дитретбутилкоричной кислоты.