Для формирования защитной реакции при проникновении патогена организм должен уметь распознавать некоторые микробные структуры и молекулы. Эти принципиально важные для выживания и вирулентности микроорганизмов структуры распознаются различными семействами эволюционно консервативных патогенраспознающих рецепторов (PRRs), которые инициирует сигнальный каскад, приводящий к транскрипции воспалительных цитокинов и хемокинов, привлекающих иммунные клетки, тем самым способствуя развитию и сохранению дальнейшей реакции адаптивного иммунитета [1, 11].
Широко известно, что ДНК бактерий (CpG-ДНК) распознаётся TLR-9 рецептором, который экспрессирует как иммунные, так и неиммунные клетки [5, 9, 10]. Несмотря на то, что основные принципы распознавания бактериальной ДНК через TLR-9 изучались на протяжении многих лет, сведения об активации TLR-9 при распознавании патогенов в условиях инфекционного процесса по-прежнему крайне ограничены. CpG-мотивы действуют на клетки организма как «сигнал тревоги», активируя врожденный и приобретенный иммунитет и во много раз усиливая ответ организма даже на низкоиммуногенные антигены [5]. Известно, что распознавание и связывание TLR-9 CpG-мотивов ДНК бактерий синтетических лигандов к рецептору приводит к активации В-клеток, к усиленной секреции ряда интерлейкинов и интерферона-α и γ [1, 2, 4, 10].
В нейтрофильных гранулоцитах (НГ) человека CpG-ДНК активирует рецептор TLR9, который индуцирует экспрессию провоспалительного хемокина IL-8 [8], необходимого для усиленной миграции и дегрануляции НГ и усиления их фагоцитарной активности, то есть играет ключевую роль в активации фагоцитов [1, 3, 6].
Поскольку определение уровня содержания цитокинов позволяет глубже понять механизм патогенеза многих заболеваний, а также оценить эффективность иммунотропных препаратов, целью работы явилось определение возможных механизмов влияния синтетических неметилированныхCpG-ДНК мотивов (коммерческий лиганд к TLR9) и фрагментов «нативной» ДНК позвоночных (иммуномодулятор Деринат) на уровень продукции in vitro IL-8 и IFN-α клетками цельной крови здоровых лиц, а также больных острой вирусной и бактериальной инфекцией.
Материалы и методы
В исследовании использована цельная кровь 55 человек с установленным диагнозом –острый бактериальный тонзиллит – (ОБТ; 25 человек), острая Эпштейн-Барр вирусная инфекция (ОЭБВИ; 30 человек) на основании клинико-лабораторных данных. Контролем служила цельная кровь 20 практически здоровых субъектов.
Цельную кровь здоровых добровольцев и пациентов с ОБТ и ОЭБВИ инкубировали с cинтетическим агонистом TLR9 - ODN2395 («Invitrogen» LifeTechnologies, США), Деринатом («Техномедсервис», Россия), а также с забуференным физраствором (ЗФР) (группы сравнения) при температуре 37 °С, в течение 24 часов, в СО2-инкубаторе «NewBrunswickScientificGalaxy 170S» (Великобритания), при моделировании блокады рецептора все пробы предварительно 1 час инкубировали с антагонистом ODN-TTAGGG. Используемый объем и концентрация агониста TLR9 ODN2395 и антагониста TLR9ODN-TTAGGG соответствовали рекомендациям производителя препаратов для экспериментов in vitro (5мкл на 1 мл крови, С = 500 мкмоль/л), для Дерината был произведен расчет с учетом средней терапевтической дозы, используемой в клинической практике in vivo (10 мкл на 1 мл крови, С = 30,82мкмоль/л). Для оценки продукции цитокинов in vitro использовали супернатанты, полученные центрифугированием после инкубации цельной стабилизированной крови здоровых лиц, а также больных острой вирусной и бактериальной инфекцией. Концентрацию IL-8 и ИНФα определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) на анализаторе ASCENT (Финляндия) с использованием соответствующей тест-системы (ЗАО ВЕКТОР-БЕСТ, г. Ростов-на-Дону, Россия).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерных программ MicrosoftExel, StatPlus 2009 с применением непараметрических тестов Вилкоксона. Результаты представляли как медианас верхним и нижним квартилем (Me(Q1-Q3)). Различия определяли значимыми при p < 0,05, незначимыми – при р>0,10; в промежуточных случаях (0,05<р≤0,10) обнаруженные эффекты обсуждали как тенденции.
Результаты
Исследованиями установлено, что после инкубации цельной крови с ЗФР определяемый уровень IL-8 в контрольной группе составил в среднем 8,65 пкг/мл, а в группах с ОЭБВИ (в 1,3 раза) и ОБТ (в 1,9 раз) был выше по сравнению со здоровыми лицами (таблица 1). При инкубации клеток цельной крови с Деринатом отмечено усиление секреции IL-8 как у здоровых лиц (в 44,7 раза), так и при ОБТ (в 18,4 раза) и ОЭБВИ (15,56 раза). Аналогичные тенденции в виде увеличения содержания IL-8 выявлены при инкубации цельной крови с агонистом TLR9 (ODN2395) во всех группах исследования. При этом в группе контроля и в группе ОЭБВИ синтез IL-8 был более интенсивно индуцирован именно Деринатом, в группе с ОБТ Деринат и агонист действовали с одинаковой интенсивностью.
Таблица 1
Влияние Дерината и агонистa TLR9 (ODN2395) на продукцию IL-8 клетками крови больных острой вирусной и бактериальной инфекцией в условиях in vitro (в пкг/мл)
|
Группа |
ЦК+ЗФР |
ЦК+Деринат |
ЦК+ ODN2395 |
|
Контроль (здоровые), n=20 |
8,65(6,24-13,97) |
386,90 (297,87-594,10) p1-2= 0,0431 |
174,70(112,75-250,90) p1-3= 0,0431 |
|
ОБТ, n=25 |
16,81(13,02-20,85) |
309,23(167,30-467,20) p1-2= 0,0033 |
360,50(186,22-432,97) p1-3= 0,0033 |
|
ОЭБВИ,n=30 |
11,23(10,51-49,01) |
174,80(118,85-428,87) p1-2= 0,0431 |
76,29(48,37-120,30) p1-3= 0,0796 |
Примечание: ЦК – цельная стабилизированная кровь; ODN2395 – агонист TLR9; ОБТ – острый бактериальный тонзиллит; ОЭБВИ – острая Эпштейн-Барр-вирусная инфекция.
p1-2 – различия при сравнении проб, инкубированных с физиологическим раствором с пробами, инкубированными с Деринатом;
p1-3 – различия при сравнении проб, инкубированных с физиологическим раствором с пробами, инкубированными с ODN2395.
Во всех исследуемых группах выявлены сходные тенденции, проявляющиеся в увеличении синтеза IFNα при инкубации проб с Деринатом и ODN2395. Влияние агониста ODN2395 на продукцию интерферона в группах с бактериальной и вирусной инфекцией примерно в два раза выше по сравнению с действием Дерината (в 1,92 раза и в 1,73 раза соответственно). В контрольной группе показатели данного цитокина незначительно выше при инкубации с Деринатом (таблица 2).
Таблица 2
Влияние Дерината и агонистa TLR9 (ODN2395) на продукцию IFNα клетками крови больных острой вирусной и бактериальной инфекцией в условиях in vitro (в пкг/мл)
|
Группа |
ЦК+ЗФР |
ЦК+Деринат |
ЦК+ ODN2395 |
|
Контроль (здоровые), n=20 |
0,93(0,86-1,19) |
2,04(1,23-3,32) p1-2= 0,0431 |
1,19(1,12-2,10) p1-3= 0,0431 |
|
ОБТ, n=25 |
1,48(0,82-1,58) |
1,64 (1,19-3,56) p1-2= 0,0033 |
3,16(1,88-2,69) p1-3= 0,0033 |
|
ОЭБВИ,n=30 |
1,25(0,69-1,70) |
2,57(1,19-3,56) p1-2= 0,0431 |
2,29(1,88-2,96) p1-3= 0,0796 |
Примечание: ЦК – цельная стабилизированная кровь; ODN2395 – агонист TLR9; ОБТ – острый бактериальный тонзиллит; ОЭБВИ – острая Эпштейн-Барр-вирусная инфекция.
p1-2 – различия при сравнении проб, инкубированных с физиологическим раствором с пробами, инкубированными с Деринатом;
p1-3 – различия при сравнении проб, инкубированных с физиологическим раствором с пробами, инкубированными с ODN2395.
Для выяснения возможного участия паттерн-распознающего рецептора фагоцитов – TLR9 в иммунотропных эффектах нуклеиновых кислот был проведен эксперимент с оценкой уровня секреции клетками цельной крови пациентов с ОЭБВИ цитокинов (IL-8 и IFNα) в условиях блокады рецептора TLR9, для чего цельную кровь пациентов предварительно инкубировали с ODN-TTAGGG (антагонист рецептора). Показано, что в присутствии блокатора ODN-TTAGGG синтез IL-8 и IFNα клетками цельной крови больных с острой вирусной инфекцией не усиливается при их инкубации с Деринатом и с агонистом TLR9, что позволяет предложить TLR9-опосредованный механизм влияния препаратов нуклеиновых кислот (таблица 3).
Таблица 3
Влияние Дерината и агонистa TLR9 (ODN2395) на продукцию IL-8 и IFNα в системе in vitro при острой вирусной инфекции в условиях блокады TLR9 его антагонистом (ODN-TTAGGG)
|
Цитокин,пкг\мл |
ЦК+ЗФР |
ЦК+Деринат |
ЦК+агонист TLR9 |
ЦК+антагонист TLR9+Деринат |
ЦК+антагонист TLR9+ агонист |
|
IL-8 |
11,23 (10,51-49,01) |
174,80 (118,85-428,87) p1-2= 0,0431 |
76,29 (48,37-120,30) p1-3= 0,0796 |
43,56 (39,22-47,90) p2-4= 0,0431 |
30,965 (23,4-38,5) p3-5= 0,0796 |
|
IFNα |
1,25 (0,69-1,70) |
2,57 (1,19-3,56) p1-2= 0,0431 |
2,29 (1,88-2,96) P1-3= 0,0796 |
1,14 (0,84-1,44) p2-4= 0,0431 |
1,19 (0,885-1,935) p3-5= 0,0796 |
Примечание: ЦК – цельная стабилизированная кровь.
p1-2 – различия при сравнении проб, инкубированных с физиологическим раствором с пробами, инкубированными с Деринатом;
p1-3 – различия при сравнении проб, инкубированных с физиологическим раствором с пробами, инкубированными с ODN2395;
p2-4 – различия при сравнении проб, инкубированных с Деринатом с пробами, предварительно инкубированными с антагонистом TLR9;
p3-5 – различия при сравнении проб, инкубированных с ODN2395 с пробами, предварительно инкубированными с антагонистом TLR9.
Заключение
Выявлены особенности влияния препаратов нуклеиновых кислот на продукцию провоспалительных цитокинов (IL-8,IFN-α) у здоровых добровольцев, а также при острой вирусной и бактериальной инфекции на примере острой ЭБВИ и при остром бактериальном тонзиллите. Установлено, что натриевая соль ДНК позвоночных (Деринат) и агонист TLR9 ODN2395 (CpG–ДНК) достоверно усиливают продукцию IL-8 во всех исследуемых группах в системе in vitro, но в наименьшей степени – у пациентов с острой ВЭБ-инфекцией. Сходство направленности большинства иммунотропных эффектов Деринатаи ODN2395 позволяет предположить TLR9-опосредованный механизм иммунотропных эффектов препаратов на основе нуклеиновых кислот и, в частности, Дерината. Между тем, имеющие место некоторые расхождения интенсивности действия Дерината и ODN2395, полученные при определении уровня IFNα в группе здоровых и больных субъектов, можно связать с отличием в строении сахарофосфатного остова у нативной и синтетической ДНК, так как известно, что фосфотиоэфирные ODN имеют гораздо более высокое сродство к TLR9, чем ODN с естественной фосфодиэфирной связью [7]. Более достоверное заключение о механизме иммунотропных эффектов нуклеиновых кислот, полученное на примере продукции некоторых провоспалительных цитокинов, дают результаты проведенного исследования таковых в условиях блокады TLR9 in vitro. Результаты исследования дают основания полагать, что фрагменты ДНК позвоночных распознаются преимущественно посредством рецептора TLR9, хотя данный механизм может быть не единственным и частично обусловленным CpG-независимой активацией TLR9.