Интерес к изучению лимфатических узлов не угасает, так как в клинической практике продолжается применение лимфотропных и эндолимфатических методик для лечения широкого круга патологий, наиболее значимыми из которых являются заболевания инфекционного генеза [3]. Поскольку лимфатический узел занимает одно из центральных мест при реализации организмом иммунного ответа и является эффекторным звеном иммунологических реакций, морфологическая оценка изменений, происходящих в этом органе, имеет огромное значение для трактовки иммунного статуса организма.
Анализ литературы показал, что в лимфатическом узле в основном рассматриваются пролиферация иммунокомпетентных клеток, антителообразование и обеспечение рециркулирующего пула лимфоцитов при различных воздействиях на лимфатический узел [4]. Клеточным компонентам лимфатического узла, синтезирующим большое количество биологически активных веществ, таким как тучные клетки (ТК), эозинофилы и макрофаги, уделяется меньше внимания, и имеющиеся данные противоречивы [5]. В то время как ТК, макрофаги и эозинофилы, присутствующие в лимфоидной ткани, влияют на микроокружение, формирование иммунного ответа и поддержание иммунного гомеостаза.
Цель исследования: изучить популяцию ТК, макрофагов и эозинофилов брыжеечных лимфатических узлов (БЛУ) при экспериментальном перитоните и после лечения лимфотропным введением цефепима (Ц).
Материалы и методы исследования
Проведено морфологическое изучение БЛУ и морфометрическое исследование популяции ТК, макрофагов и эозинофилов при лечении экспериментального перитонита лимфотропным введением Ц в течение 7 суток в дозе 80 мг/кг. Для оценки отдаленных последствий лимфотропного введения антибиотика БЛУ забирали через 1 и 2 месяца после лечения Ц. В качестве отрицательного и положительного контроля использовали БЛУ интактных крыс и крыс после суточного перитонита.
Исследование проведено на 40 беспородных белых крысах-самцах массой 250-320 г, по 5 животных на каждую точку. Экспериментальный 24-часовой перитонит моделировали при помощи инъекции 20%-ной каловой взвеси внутрибрюшинно. Через сутки у животных под наркозом выполняли лапаротомию, ревизию и санацию брюшной полости раствором хлоргексидина. Для наркоза использовали препарат «Золетил 100» в дозировке 0,1-0,2 мг/кг, вводимый внутрибрюшинно. После завершения оперативного вмешательства животным лимфотропно в область тыла стопы задней конечности вводили Ц один раз в сутки [1]. Выбор Ц в качестве тестируемого препарата был сделан на основании рекомендаций РАСХИ по лечению перитонита [1; 7].
Эвтаназию всех крыс проводили путем ингаляции 100%-ного углекислого газа. При выполнении экспериментальных исследований руководствовались требованиями Приказа № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996) и в соответствии с рекомендациями Этического комитета ГБОУ ВПО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова». Все БЛУ фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН 7.4) в течение суток. По стандартной гистологической методике получали парафиновые блоки, срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (Bio-Optica, Италия) и по методу Романовского – Гимза («ЭргоПродакшн», Россия). Для визуализации ТК применяли толуидиновый синий (Bio-Optica, Италия). Микроскопический анализ проводили на световом микроскопе Leica DM750 (Германия) при увеличении в 100 и 400 раз. Оценку относительного объёма, занимаемого в лимфатических узлах ТК, макрофагами и эозинофильными лейкоцитами, проводили стереологическим методом точечного счёта, используя тест-сетку окулярного микрометра с 25 точками при увеличении х280 [6]. Данные получали при регистрации 1000 точек.
Статистическая значимость различий измеряемых параметров между группами рассчитывалась методом Вальда-Вольфовица. Значение P менее 0,05 рассматривали в качестве значимого.
Результаты исследования и их обсуждение
Строение БЛУ у интактных животных соответствует классическому гистологическому описанию. Корковое вещество представлено лимфоидными фолликулами со светлыми герминативными центрами. Мозговые синусы широкие, содержат небольшое количество свободных макрофагов и лимфоцитов. В лимфатических узлах отмечается умеренное полнокровие сосудов микроциркуляторного русла. ТК располагаются в основном субкапсулярно, а также в мозговых тяжах. Визуализировали активные макрофаги с выраженной, неправильной формы, вакуолизированной цитоплазмой, имеющие округлое или бобовидное ядро с нежно-дисперсным хроматином. Макрофаги встречаются в фолликулах, в просвете синусов и в мозговых тяжах. Эозинофилы находятся преимущественно в мозговых тяжах и субкапсулярно. Морфометрический анализ БЛУ интактных животных показал, что относительный объём, занимаемый макрофагами, составляет 7,58%, относительный объём, занимаемый ТК, так же как и относительный объём, занимаемый эозинофилами, составляет 1,22% (таблица).
Относительный объём, занимаемый в брыжеечных лимфатических узлах тучными клетками, макрофагами и эозинофильными лейкоцитами (%)
|
Интактные животные (отрицательный контроль) |
24-часовой перитонит (положительный контроль) |
7 сут. введения цефепима |
1 месяц после окончания лечения цефепимом |
2 месяца после окончания лечения цефепимом |
|
|
Макрофаги
|
7,58 |
12,44 p =0,17
|
10,68 p =0,50
|
5,18 p =0,50
|
5,82* p =0,04
|
|
Тучные клетки |
1,22 |
0,06* p =0,007
|
0,00* p =0,007
|
0,46* p =0,007
|
0,3* p =0,007
|
|
Эозинофилы
|
1,22 |
1,28* p =0,044
|
0,64 p =0,50
|
0,34 p =0,17
|
0,62 p =0,50
|
* - различия статистически значимы (p<0,05) по сравнению с уровнем показателей в группе отрицательного контроля.
После 24-часового перитонита в БЛУ отмечается фолликулярная гиперплазия, нарушение микроциркуляции, межклеточный отек, расширение мозговых и корковых синусов с появлением в них лимфоцитов, макрофагов и единичных плазматических клеток. Мозговые тяжи обильно инфильтрированы макрофагами и эозинофилами, в то время как ТК единичны. Морфометрический анализ показал достоверное изменение относительного объема клеток по сравнению с группой интактных животных: увеличение относительного объема эозинофилов до 1,28%, уменьшение относительного объема ТК в 20 раз до 0,06%, относительный объём макрофагов увеличивается до 12,44% (таблица).
После лечения перитонита лимфотропным введением Ц в течение 7 суток в БЛУ сохраняются проявления нарушения микроциркуляции, но отмечается уменьшение межклеточного отека. В просвете синусов видны единичные лимфоциты и макрофаги. Макрофаги и эозинофилы располагаются в мозговых тяжах. Эозинофилы выявляются субкапсулярно. После лечения Ц относительный объём макрофагов незначительно понизился по сравнению с данными в группе после 24-часового перитонита и составил 10,68%, что соответствует 141% от значений в группе интактных животных. ТК в лимфатическом узле после лечения Ц не выявлялись. Относительный объём эозинофилов продолжал снижаться до 0,64%, что соответствует 52% от значений в группе интактных животных (таблица).
Через месяц после лечения препаратом в БЛУ отмечается умеренное полнокровие сосудов микроциркуляторного русла, мозговые синусы находятся в спавшемся состоянии. Расположение макрофагов и эозинофилов соответствует таковому в группе интактных животных, однако количество этих клеток резко снижается по сравнению с количеством клеток в БЛУ при перитоните и после лечения и не достигает контрольных значений. Относительный объём, занимаемый макрофагами и эозинофилами в БЛУ, снизился до 5,18% и 0,34% соответственно, что составляет 68% и 28% от значений в группе интактных животных. ТК встречаются в мозговых тяжах и субкапсулярно. Их относительный объём возрастает по сравнению с данными после 24-часового перитонита и после лечения Ц, составляет 0, 46%, что соответствует всего 38% от значений в группе интактных животных (таблица).
Через 2 месяца после лечения перитонита лимфотропным введением Ц структура БЛУ соответствует строению органа в группе интактных животных. Макрофаги встречаются в мозговых тяжах, в просвете синусов и в фолликулах. Относительный объём, занимаемый ими, равен 5,82%, что соответствует 77% от значений в группе интактных животных, и достоверно отличаются от них. Эозинофилы находятся субкапсулярно и в мозговых тяжах. Относительный объём, занимаемый эозинофилами, возрастает до 0, 62%, что соответствует 51% от значений в группе интактных животных. ТК определяются в мозговых тяжах и субкапсулярно. Их относительный объём снижается до 0,3%, что достоверно отличается от значений в группе интактных животных и составляет 25% контрольных значений (таблица).
В нашем исследовании интраабдоминальная инфекция приводит к резкому нарушению численности популяций ТК, макрофагов и эозинофилов, которые синтезируют биологически активные вещества, участвующие в поддержании гомеостаза и в выработке адаптационных механизмов органа [9].
Под влиянием эндотоксинов бактерий при перитоните при активации фосфолипазы А2 усиливается дегрануляция ТК [8]. В нашей работе при экспериментальном перитоните в БЛУ выявлялись лишь единичные ТК, относительный объём, занимаемый этими клетками, составил всего 4,9% от значений в группе интактных животных. Отметим, что макрофаги, количество которых резко возросло при перитоните, также оказывают влияние на ТК. Под действием ИЛ-1, секретируемого макрофагами, осуществляется выброс содержимого везикул ТК. Мобилизации эозинофилов в БЛУ при перитоните способствует воспалительный процесс, вызванный микроорганизмами, хемотаксический фактор иммиграции эозинофилов, секретируемый ТК, а также макрофаги, участвующие в развитии эозинофильной реакции.
После 7-дневного курса лечения перитонита лимфотропным введением Ц количество макрофагов уменьшилось по сравнению с данными в группе животных с экспериментальным перитонитом, но в целом оставалось на высоком уровне, что, вероятно, продолжало оказывать влияние на популяцию ТК. В процессе лечения произошла полная дегрануляция гранул ТК, поэтому ТК не выявляются и относительный объём, занимаемый ими в БЛУ после применения Ц, равняется нулю. Количество эозинофилов после лечения также резко упало и составило 52% от значений в группе интактных животных.
Через месяц после лечения перитонита лимфотропным введением Ц в БЛУ появляется небольшое количество ТК, их относительный объём составляет 38% от значений в группе интактных животных. Количество макрофагов и эозинофилов снижено по сравнению с данными группы интактных животных и составляет 68% и 28% соответственно. Через два месяца не происходит восстановления популяций ТК, макрофагов и эозинофилов. Количество ТК остаётся минимальным, и относительный объём, занимаемый ими в БЛУ, составляет лишь 25% от значений в группе интактных животных. Относительный объём, занимаемый макрофагами, составляет 77%, эозинофилами – 51% от значений в группе интактных животных.
В нашей работе при экспериментальном перитоните и дальнейшем лечении лимфотропным введением Ц проявляются грубые количественные изменения в популяции ТК, макрофагов и эозинофилов. Наиболее чувствительными к эндотоксинам и лимфотропному введению антибиотика являются ТК.
Уменьшение популяции ТК БЛУ может быть обусловлено как нарушением их миграции в лимфатический узел, так и нарушением и/или замедлением образования новых гранул. Об этом свидетельствует пониженное количество эозинофилов, реагирующих на хемотаксический фактор иммиграции, вырабатываемый ТК. Нарушение миграции ТК с уменьшением их числа в БЛУ, возможно, связано с недостатком хемоаттрактантов, выделяемых макрофагами, количество которых, в свою очередь, не восстанавливается до контрольных значений. Нарушение образования гранул ТК происходит, возможно, под действием Ц. При лимфотропном введении Ц нарушается моторика лимфангионов, что приводит к депонированию препарата в БЛУ и, как следствие, к более длительному воздействию антибиотика [1]. В настоящее время установлено, что антибиотики связываются, депонируются и сохраняют активность во внутриклеточном пространстве лимфоцитов и макрофагов. Лимфоциты и макрофаги, депонирующие антибиотик, при взаимодействии с микробами и их токсинами разрушаются и происходит дополнительный выход препарата [2].
Заключение. Таким образом, при лимфотропном введении Ц удаётся получить высокую концентрацию антибиотика и, вероятно, его более длительное воздействие. При этом популяции ТК, макрофагов и эозинофилов резко нарушаются и не восстанавливаются через 2 месяца после лечения. Изменения в популяции клеток, синтезирующих биологически активные вещества, могут вызывать нарушения в формировании реакций как неспецифического, так и специфического иммунитета, что необходимо учитывать при антибиотикотерапии.