Следствием различных видов физических нагрузок, как у юных спортсменов, так и спортсменов высокой квалификации является активация свободнорадикального окисления (СРО), что расценивается как универсальный механизм реагирования организма [14]. Однако интенсивность и продолжительность повышения СРО имеют определенную зависимость от уровня тренированности, аэробных возможностей организма, характера физических нагрузок (вид, интенсивность, частота, продолжительность), преобладающих механизмов энергообеспечения мышечной работы [16, 6]. Актуальным является вопрос об управлении свободнорадикальными процессами с целью профилактики и коррекции их негативных последствий. В организме существует многоуровневая система (клеточная и внеклеточная; ферментативная и неферментативная), контролирующая СРО. К регуляторам широкого спектра биохимических и физиологических процессов в организме относится церулоплазмин, механизмы влияния которого реализуются, в том числе и через его антиоксидантные свойства [8, 10, 11, 9].

Цель исследования – в условиях эксперимента определить эффективность влияния церулоплазмина (ЦП) относительно интенсивности СРО цельной крови и сыворотки при хронической физической нагрузке умеренной мощности.

Материалы и методы. Исследование проведено на белых беспородных крысах. Все эксперименты выполнены согласно Европейской Конвенции по защите экспериментальных животных. Хроническая физическая нагрузка умеренной мощности моделировалась ежедневным плаванием в течение 30 минут – 21 день. На 9, 15 и 21 день эксперимента, животные подвергались дополнительно физической нагрузке: плавали в течение 4-х минут с грузом массой 20 % от веса тела. Подобная экспериментальная модель аналогична тренировочному циклу подготовки спортсменов к соревновательному периоду. Забор крови производили на 9, 15, 21 сутки через 15–20 минут после нагрузки. Церулоплазмин вводился 3 раза (на 1, 4 и 7 сутки физической нагрузки) в суммарной дозе 60 мг/кг массы тела. Интенсивность СРО в цельной крови исследовали хемилюминесцентным методом в присутствии люминола на приборе «Хемилюминомер-003» с компьютерным обеспечением [12, 2]. Первоначально регистрировали базальную хемилюминесценцию (ХЛ) цельной крови: светосумму (СС) и максимальную светимость (МС). Далее в этих же пробах после инкубации регистрировали ХЛ - индуцированную. С учетом того, что основным источником свободных радикалов в цельной крови являются нейтрофилы, их активации (за счет адгезии к стеклянной поверхности) способствовала инкубация образцов крови (60 минут при 37 ⁰С). Параллельно в крови подсчитывали общее количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу. ХЛ крови выражали в абсолютных величинах и с пересчетом на количество нейтрофилов (10⁵/мл). Интенсивность пероксидации, как составляющей СРО, изучали методом железоиндуцированной хемилюминесценции сыворотки крови [12, 2]. Оценивали спонтанную и железоиндуцированную хемилюминесценцию (добавлением Fe²⁺ - 50 мкМ). Регистрацию хемилюминесценции сыворотки крови осуществляли на хемилюминомере ХЛ-003 с компьютерным обеспечением.

Продукты ПОЛ в крови оценивали спектрофотометрическим методом в изопропаноловой фракции с расчетом индексов окисления [3]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали в реакции восстановления нитросинего тетразолия [13]; активность каталазы определяли в цветной реакции с молибдатом аммония [7]; активность глютатион – редуктазы оценивали по способности окислять НАДН при длине волны 340 нм [1]; содержание церулоплазмина оценивали модифицированным методом Равина по способности окислять р-фенилендамин [5]. Общую антиокислительную активность (ОАО) оценивали фотометрическим тестом ImAnOx(TAS/TAC) Kit фирмы Immundiagnostik (Германия) по степени подавления оксидации в присутствии перекиси водорода. Статистическая обработка результатов исследования проводилась на персональном компьютере с помощью пакета программ анализа данных Statistica 6.0. Для оценки достоверности полученных результатов использовали непараметрический критерий Манна – Уитни.

Результаты исследования

ХФН умеренной мощности приводила к постепенному повышению базального свечения (СС и МС) в цельной крови относительно контроля. При этом индуцированное свечение цельной крови (СС и МС) было достоверно ниже контрольных значений (таблица 1). Основными источниками свободных радикалов в крови являются нейтрофилы, количество которых при физической нагрузке возрастает в 1,5 раза. При пересчете интенсивности базальной и индуцированной ХЛ крови на х10⁵ нейтрофилов СС и МС достоверно снижаются (таблица 2). Показатели индуцированного свечения нейтрофилов к 21 суткам снижаются примерно в 3 раза. Таким образом, возрастание ХЛ цельной крови обусловлено увеличением в крови нейтрофильных лейкоцитов на фоне снижения их способности к продукции радикалов.

Введение ЦП при ХФН способствовало еще большему уменьшению продукции свободных радикалов нейтрофилами (15, 21 сутки); на 9–21 снижалась МС индуцированного свечения (таблица 2). Следствием этого было достижение нормальных величин базального свечения (СС и МС) в цельной крови, а СС и МС индуцированного свечения на 21 сутки приобретали самые низкие значения (таблица 1).

При физической нагрузке в сыворотке крови не изменялась спонтанная светимость (СПС), постепенно повышались: СС, амплитуда быстрой и медленной вспышки. ЦП не влиял на СПС, амплитуду медленной вспышки; на 21 сутки нормализовал амплитуду быстрой вспышки; повышал длительность латентного периода. В итоге под влиянием ЦП снижалась, но не нормализовалась светосумма свечения (таблица 3).

Таблица 1

Влияние ЦП на ХЛ цельной крови при физической нагрузке умеренной мощности (М±m)

* – достоверность  (р≤0,05) относительно контроля; ^ – достоверность относительно аналогичного срока физической нагрузки.

Таблица 2

Влияние ЦП на ХЛ нейтрофилов (х10⁵) при физической нагрузке умеренной мощности (М±m)

* – достоверность  (р≤0,05) относительно контроля; ^ – достоверность относительно аналогичного срока физической нагрузки.

Таблица 3

Влияние ЦП на ХЛ сыворотки крови при физической нагрузке умеренной мощности (М±m)

* – достоверность  (р≤0,05) относительно контроля; ^ – достоверность относительно аналогичного срока физической нагрузки.

Таблица 4

Влияние ЦП на продукты ПОЛ в крови при физической нагрузке умеренной мощности (М±m)

 * – достоверность  (р≤0,05) относительно контроля; ^ – достоверность относительно аналогичного срока физической нагрузки.

Таблица 5

Влияние ЦП на компоненты антиокислительной системы в крови при физической нагрузке умеренной интенсивности (М±m)

 * – достоверность  (р≤0,05) относительно контроля; ^ – достоверность относительно аналогичного срока физической нагрузки.

В крови при нагрузке возрастали общие, первичные и промежуточные продукты ПОЛ. За счет параллельного возрастания общих, первичных и промежуточных продуктов ПОЛ, их индексы окисления не изменялись. Под влиянием ЦП к 9 сутками произошла нормализация общих и промежуточных продуктов, к 21 суткам – первичных продуктов ПОЛ (таблица 4).

ХФН умеренной мощности влияла на состояние антиокислительной системы. В частности, к 9 суткам снижалась активность СОД и каталазы при восстановлении их активности к 21 суткам. Активность глютатион-редуктазы, содержание ЦП (9–21 сутки) были повышены. На 21 сутки была повышена общая антиокислительная активность (ОАА). Введение ЦП приводило лишь к нормализации активности каталазы (таблица 5).

Обсуждение

Итак, при ХФН умеренной мощности активируются свободнорадикальные процессы в цельной крови и ПОЛ в сыворотке. Это является следствием миогенного лейкоцитоза и нагрузочной гипоксии с дальнейшей реализацией компенсаторно-адаптивных процессов. Гипоксия инициирует образование активных форм кислорода с последующим развертыванием свободно-радикальных и перекисных реакций через умеренную мобилизацию эндогенных жирных кислот и стимуляцию симпатоадреналовой системы. Кислородные радикалы являются факторами формирования активированного состояния митохондрий. Кроме того, свободнорадикальные реакции обеспечивают поддержание интенсивного энергетического обмена и привлечения продуктов свободнорадикального окисления к метаболическим процессам. Основное действие ЦП при ХФН умеренной мощности проявилось на уровне нейтрофилов. Трехкратное введение ЦП приводило к снижению продукции свободных радикалов нейтрофильными лейкоцитами и ХЛ цельной крови. ЦП противостоял снижению активности каталазы, увеличивал длительность латентного периода, который в литературе рассматривается в качестве интегрального показателя мощности антиокислительной системы [4]. Восстановление активности каталазы под влиянием ЦП может быть связано с его дисмутирующей способностью. Указывается, что ЦП обладает СОД активностью [9, 4]. В плазме крови его действие аналогично действию клеточной СОД. Он восстанавливает О^-₂ с помощью пары Си²⁺ до Н₂О, перехватывает свободные кислородные радикалы и предохраняет липидосодержащие структуры от их повреждающего действия [9]. ЦП в отличие от СОД не катализирует реакцию диспропорционирования, а взаимодействуют с предшественниками О₂ радикалов. Восстановление активности каталазы под влиянием ЦП может быть связано с дополнительным разрушением О^-₂ и защитой каталазы от его инактивирующего влияния, при этом снижается вероятность восстановления трехвалентного железа и возможность образования ОН^-, который служит прооксидантом ПОЛ [4]. Некоторые авторы считают ЦП антиоксидантом, который вызывает обрыв цепи свободных радикалов, перехватывает супероксидные радикалы, ингибирует аутоокисление липидов, не связывая эти эффекты с его ферроксидазной активностью [9]. Кроме того, ЦП может способствовать накоплению в клетках антиоксиданта глютатиона [15]. Все это может быть объяснением факта нормализации содержания общих, первичных и промежуточных продуктов ПОЛ и снижению железоиндуцированной ХЛ сыворотки крови под влиянием ЦП.

Выводы

1. При ХФН умеренной мощности активируются свободнорадикальные процессы в цельной крови и ПОЛ в сыворотке; возрастает общая антиокислительная активность.
2. Трехкратное введение ЦП в суммарной дозе 60 мг/кг массы тела приводило к снижению продукции свободных радикалов нейтрофильными лейкоцитами и ХЛ цельной крови.
3. ЦП увеличивал длительность латентного периода, отражающего суммарную мощность антиокислительной системы, тем самым способствовал снижению железоиндуцированной ХЛ сыворотки крови и нормализации содержания общих, первичных, промежуточных продуктов ПОЛ.