Интенсивные физические нагрузки запускают окислительный стресс, значительно возрастающий в состоянии перенапряжения [13, 6]. Для коррекции негативных последствий физической нагрузки, особенно у недостаточно тренированных людей, и восстановления работоспособности эффективным может быть использование эндогенных веществ мультифакторного действия, в том числе и антиоксидантной направленности действия [12,9]. К группе подобных веществ относится церулоплазмин, функции которого разнообразны: главный антиоксидант крови; участник метаболизма железа; способен влиять на клеточный состав крови, гемостаз, проявления дислипидемии и др. [11,14,1].

Цель исследования – в условиях эксперимента выяснить влияние церулоплазмина (ЦП) на интенсивность свободнорадикального окисления в крови и сыворотке при острой физической нагрузке.

Материалы и методы. Исследование проведено на белых беспородных крысах, массой 200–250 грамм. Все эксперименты выполнены согласно Европейской Конвенции по защите экспериментальных животных. Было сформировано три группы животных. Первая группа (контрольная) – интактные животные. Вторая группа – моделировалась острая физическая нагрузка (ОФН). Нетренированные крысы плавали в течение 4-х минут с грузом массой 20 % от массы тела. Третья группа – за сутки до нагрузки однократно вводился церулоплазмин (НПО «Иммунопрепарат», Уфа) в дозе 50 % от физиологической концентрации в крови. Забор крови производился через 15–20 минут после физической нагрузки.

Интенсивность СРО в цельной крови исследовали методом люминол-усиленной хемилюминесценции (ХЛ) [15, 3]. Регистрировали базальную и индуцированную хемилюминесценцию цельной крови: светосумму (СС, у.е.•мин) и максимальную светимость (МС, у.е.) [2]. Показатели базальной и индуцированной ХЛ рассчитывали на 10⁵ нейтрофильных лейкоцитов.

Интенсивность пероксидации липидов, как составляющей СРО, изучали методом железоиндуцированной хемилюминесценции сыворотки крови [15, 3].

Продукты ПОЛ в крови оценивали спектрофотометрическим методом в изопропаноловой фракции [4]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали в реакции восстановления нитросинего тетразолия [16]; активность каталазы определяли в цветной реакции с молибдатом аммония [8]; активность глютатионредуктазы оценивали по способности окислять НАДН при длине волны 340 нм [2]; уровень церулоплазмина оценивали модифицированным методом Равина по способности окислять р-фенилендамин [7]. Общую антиокислительную активность (ОАО) оценивали фотометрическим тестом ImAnOx(TAS/TAC) Kit фирмы Immundiagnostik (Германия) по степени подавления оксидации в присутствии перекиси водорода. Статистическая обработка результатов исследования проводилась на персональном компьютере с помощью пакета программ анализа данных Statistica 6.0. Для оценки достоверности полученных результатов использовали непараметрический критерий Манна – Уитни.

Результаты исследования

ОФН привела к активации процессов СРО в цельной крови (табл. 1). Базальное светечение: светосумма (СС) возросла на 42 %, максимальная светимость (МС) на 48 %. СС индуцированного свечения увеличилась на 136 %, МС на 177 %. ОФН сопровождается миогенным лейкоцитозом, причем происходит достоверное увеличение нейтрофилов в абсолютных числах в 1,5 раза по сравнению с контролем. Пересчет на нейтрофильные лейкоциты, так как они являются основными источниками свободных радикалов, показал, что снижается базальное свечение (СС и МС) на 32 и 26 % соответственно; индуцированное свечение не меняется. Церулоплазмин практически не влияет на ХЛ цельной крови и производство свободных радикалов нейтрофильными лейкоцитами, способствуя лишь снижению относительно контроля СС индуцированного свечения при пересчете на нейтрофилы.

Таблица 1

Хемилюминесценция цельной крови при острой физической нагрузке и при введении церулоплазмина (М±m;σ)

Достоверность по критерию Манна – Уитни: * – относительно контроля; ^ – относительно ОФН.

Острая физическая нагрузка не приводит к увеличению спонтанной светимости сыворотки крови, что говорит о сохранении стационарного состояния оксиданты-антиоксиданты (табл. 2). При ОФН возрастает СС за счет амплитуды быстрой вспышки, отражающей процессы накопления гидроперекисей липидов, и амплитуды медленной вспышки, максимально возможной интенсивности пероксидации липидов (ПОЛ). ЦП не изменяет спонтанную светимость сыворотки крови, не снижает светосумму свечения и амплитуду медленной вспышки; снижает, но не нормализует амплитуду быстрой вспышки; повышает длительность латентного периода, отражающего суммарную антиокисидантную активность сыворотки крови.

Таблица 2

Хемилюминесценции сыворотки крови при острой физической нагрузке и при введении церулоплазмина (М±m; σ)

Достоверность по критерию Манна – Уитни: * – относительно контроля; ^ – относительно ОФН.

В крови при нагрузке возрастает содержание общих, первичных и промежуточных продуктов ПОЛ (табл. 3). Введение ЦП приводит к нормализации общих и промежуточных продуктов ПОЛ.

Таблица 3

Динамика продуктов ПОЛ в сыворотке крови при острой физической нагрузке и при введении церулоплазмина (М±m; σ)

Достоверность по критерию Манна – Уитни: * – относительно контроля; ^ – относительно ОФН.

Состояние антиоксидантной системы в сыворотке крови при острой физической нагрузке и введении ЦП представлено в таблице 4. В сыворотке крови при ОФН снижается активность каталазы, не изменяется активность СОД и глютатион-редуктазы, повышается церулоплазмин и общая антиокислительная активность. Глютатион-редуктаза, восстанавливающая окисленный глютатион, функционально связана с глютатион-пероксидазой. Введение ЦП приводит к повышению его в крови, нормализации активности каталазы, увеличению активности глютатион-редуктазы относительно контроля, не влияя на мощность общей антиокислительной активности.

Таблица 4

Антиокислительные системы в сыворотке крови при острой физической нагрузке и при введении ЦП (М±m; σ)

* – достоверность по критерию Манна – Уитни относительно контроля; ^ – относительно ОФН.

Обсуждение. В настоящее время многочисленные публикации посвящены генерации активных форм кислорода их физиологическому и патологическому действию [10, 5]. Следствием ОФН у нетренированных крыс является увеличение свободных радикалов за счет активации свободнорадикальных процессов в цельной крови, наиболее вероятно связанных с миогенным лейкоцитозом. Это предположение подтверждается снижением СС и МС базального свечения при пересчете на нейтрофилы. Потенциальная способность нейтрофилов к продукции радикалов при ОФН не изменяется, так как величины индуцированного свечения в пересчете на нейтрофилы остаются в пределах контрольных значений. Железоиндуцированная ХЛ и содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови указывают на интенсификацию пероксидации липидов. При ОФН имеется дисбаланс между и ферментативными и неферментативными антиоксидантами и возрастание церулоплазмина, длительности латентного периода и общей антиокислительной активности не компенсирует свободнорадикальную нагрузку. Кроме того, отсутствуют согласованные изменения активности СОД, каталазы и глютатиопероксидазы. Указывается, что активность, стабильность и согласованное действие ключевых ферментов должны быть взаимосвязаны, так как СОД, каталаза, глютатионпероксидаза могут инактивироваться одним из продуктов их ферментативной реакции [5, 17,18]. Более того, продукты ПОЛ являются потенциальными ингибиторами глютатионпероксидазы [5]. Церулоплазмин относится к высокомолекулярным неферментативным антиоксидантам. Антиоксидантные свойства церулоплазмина связаны с хелаторным действием относительно двухвалентных ионов меди, способностью окислять двухвалентное железо и дисмутацией супероксидного анион-радикала [5]. Предварительное введение церулоплазмина не достаточно эффективно относительно ХЛ цельной крови и сыворотки. В крови нет нормализации абсолютных значений базальной и индуцированной ХЛ (светосуммы и максимальной светимости), несмотря на снижение функциональной возможности нейтрофилов к продукции свободных радикалов после введения ЦП. В сыворотке крови на фоне повышения латентного периода не нормализуются – светосумма свечения, амплитуда быстрой и медленной вспышки, первичные продукты ПОЛ. Введение церулоплазмина не способствует дополнительному повышению мощности общей антиокислительной активности (ОАА), но приводит к возрастанию активности каталазы и глютатиоредуктазы. Таким образом, в условиях интенсивной генерации свободных радикалов предварительное введение церулоплазмина не достаточно эффективно. Более того, существует опасность, что церулоплазмин, как металл-связывающий белок, при окислительном стрессе, снижении рН крови и окислительной деструкции может быть источником активных форм металлов переменной валентности [5], провоцирующих свободнорадикальное окисление.

Выводы

У нетренированных крыс предварительное однократное введение церулоплазмина в дозе 50 % от физиологического уровня не приводит к нормализации свободнорадикальных процессов в крови и сыворотке, инициированных острой физической нагрузкой.