Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

MOLECULAR GENETIC ANALYSIS OF POPULATIONS OF POPULUS NIGRA L. IN THE MIDDLE AND SOUTHERN URALS BASED ON POLYMORPHISM OF ISSR-MARKERS

Nikonoshina N.A. 1 Martynenko N.A. 1 Nechaeva Yu.S. 1, 2 Prishnivskaya Ya.V. 1, 2 Boronnikova S.V. 1
1 Perm State University
2 Natural-Science Institute of Perm State University
Молекулярно-генетический анализ проведен у четырех популяций Populus nigra L., расположенных на Среднем и Южном Урале. В четырёх изученных популяциях тополя чёрного на Среднем и Южном Урале выявлено 49 ISSR-маркеров, из которых 43 (Р95=0,878) были полиморфными. Наибольшие значения параметров генетического разнообразия отмечены в популяции P. nigra Pn_4 (HE=0,233; ne=1,425; R=2; Р95=0,788), а наименьшие – в популяции Pn_1 (HE=0,187; ne=1,302; R=0). Наименьшая доля полиморфных локусов (Р95=0,725) отмечена в популяции Pn_3. Наименьшее генетическое расстояние между исследуемыми популяциями P. nigra отмечено между Pn_2 «Бирск» и Pn_4 «Стерлитамак» (D=0,132), наиболее генетически удаленными являются популяции Pn_1 «Спасская гора» и Pn_4 «Стерлитамак» (D=0,242). Анализ генетической структуры изученных популяций показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей выборке (HT) составила 0,291, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции (HS) – 0,221, поэтому коэффициент подразделенности популяций (GST) невысок и равен 0,239. На межпопуляционную компоненту генетического разнообразия тополя чёрного приходится 23,9%, а на внутрипопуляционную – 76,1%. Из этого следует, что изученные популяции P. nigra на Среднем и Южном Урале дифференцированы в средней степени. Даны рекомендации по сохранению генетического разнообразия изученных популяций тополя чёрного на Среднем и Южном Урале.
Molecular genetic analysis was conducted on four populations of Populus nigra L., located on the Middle and Southern Urals. Forty nine ISSR-markers was identified on studied populations of black poplar; 43 of them (Р95=0,878) were polymorphic. The maximum values of genetic diversity was in population of P. nigra Pn_4 (HE=0,233; ne=1,425; R=2; P95=0,788) and minimum in population Pn_1 (HE =0,187; ne=1,302; R=0). The lowest proportion of polymorphic loci (P95 = 0,725) was in population Pn_3. The least genetic distance between studied populations of P. nigra noted between Pn_2 «Birsk» and Pn_4 «Sterlitamak» (D=0,132), populations Pn_1 «Spasskaya gora» and Pn_4 «Sterlitamak» were the most genetically remote (D=0,242). Analysis of the genetic structure of studied populations showed, that the expected proportion of heterozygous genotypes in the total sample (HT) was 0,291, and the expected proportion of heterozygous genotypes in a subset (HS) was 0,221, so the ratio of population subdivision (GST) was low and was equal 0,239. Almost 24% accounted on the inter-population component of genetic diversity of black poplar and almost 76% – on intra-population. From this it followed, that the studied population of P. nigra in the Middle and Southern Urals differentiated moderate. The recommendations for the conservation of genetic diversity of studied populations of black poplar in the Middle and South Urals were given.
DNA polymorphism
genetic diversity of issr-pcr markers
genetic structure of populations
populus nigra l.

Для разработки стратегии сохранения и рационального природопользования лесных ресурсов, обеспечивающей удовлетворение экономических потребностей общества и охрану биоразнообразия природных сообществ, необходимы глубокие знания о состоянии генофондов основных лесообразующих древесных видов растений [2]. Род Populus является модельным для генетических исследований древесных видов растений благодаря небольшому размеру генома, незначительной генетической изменчивости, быстрым темпам роста по сравнению с другими древесными видами [9]. Populus trichocarpa L. – первый вид из древесных растений, чей геном был секвенирован [13]. P. nigra играет важнейшую роль при сохранении пойменных экосистем и используется как источник древесины в промышленности и строительстве. Большое генетическое разнообразие и проблемы в таксономии клонов и гибридов указывают на применение именно популяционного подхода для изучения P. nigra [14]. Геном тополя чёрного не секвенирован полностью, но посредством молекулярного маркирования и SNP (Single Nucliotide Polymorphism) активно изучается как ядерная [5; 6; 12], так и хлоропластная [8; 15], а также митохондриальная ДНК [7]. В Пермском крае изучено генетическое разнообразие популяций тополя дрожащего на основании полиморфизма ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats)-PCR маркеров и SNP-маркеров [4]. Генетическое разнообразие популяций P. nigra изучено на Среднем и Южном Урале на основе полиморфизма SSR (Single Nucleotide Repeats)-PCR маркеров [3], которые выявляют полиморфизм микросателлитных локусов. В качестве молекулярных маркеров, как показано на примере других видов тополей (P. tremula) на Урале [4], эффективны ISSR-маркеры, используемые при анализе полиморфизма межмикросателлитных последовательностей. Изучение генетического разнообразия, генетической структуры и дифференциации популяций тополя чёрного на Среднем и Южном Урале на основании межмикросателлитного анализа ранее не проводилось.

Целью данного исследования являлось определение генетического разнообразия и генетической структуры у четырёх популяций P. nigra на Среднем и Южном Урале на основании полиморфизма ISSR-PCR маркеров.

Материал и методы исследования

Объектами исследований являлись четыре популяции P. nigra из разных ботанико-географических районов Среднего и Южного Урала: первая популяция (Pn_1, или Спасская гора), расположенная в историко-природном комплексе «Спасская гора» в зоне островной Кунгурской лесостепи южной тайги Пермского края (Средний Урал); вторая популяция (Pn_2, или Бирск) находится около г. Бирск Республики Башкортостан в лесостепном районе Южного Урала; третья популяция (Pn_3, или Стерлитамак), расположенная около г. Стерлитамак Республики Башкортостан в степном районе Южного Урала; четвертая популяция (Pn_4, или Инзер) находится на территории Южно-Уральского заповедника в горном районе Южного Урала. Минимальное географическое расстояние между популяциями составило около 137 км (между Pn_3 и Pn_4), а максимальное – около 380 км (между Pn_1 и Pn_3).

Для молекулярно-генетического анализа P. nigra были собраны листья с 30-32 случайно избранных деревьев на расстоянии не менее 50 м друг от друга. Для выделения ДНК использовали модифицированную методику S.O. Rogers [11], в которой использовали в качестве детергента СТАВ+PVPP (цетилтриметиламониум бромид + поливинилполипирролидон). При выделении ДНК из листьев брали навеску по 100 мг. Концентрацию ДНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA) и для ПЦР выравнивали до 10 нг/мкл.

Анализ генетического разнообразия популяций P. nigra проведен ISSR-методом анализа полиморфизма ДНК [16]. Для полимеразной цепной реакции ISSR-PCR-методом реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 2 единицы Tag-полимеразы («Силекс М», Россия); 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР («Силекс М», Россия); 25 пМ праймера («Синтол», Россия); 2,5 мМ MgCl2 («Силекс М», Россия); 0,25 мM dNTP («Fermentas», Литва); 5 мкл тотальной ДНК. Амплификацию ДНК проводили в термоциклере GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США) по стандартной для ISSR-PCR-метода программе [1] с пятью ISSR-PCR-праймерами. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,7%-ном агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации GelDoc XR (Bio-Rad, USA). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярного веса ООО «СибЭнзим-М» (Москва) и программу Quantity One (Bio-Rad, USA).

Компьютерный анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК проведен с помощью общепринятых компьютерных программ POPGENE 1.31 и специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel с определением доли (Р95) полиморфных локусов, абсолютного (na) числа аллелей, эффективного (ne) числа аллелей, ожидаемой (HE) гетерозиготности. Для описания генетической структуры популяции были использованы следующие параметры: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов () во всей популяции, как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов () в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций ().

На основе матрицы бинарных признаков была рассчитана матрица генетических различий, на основании которой невзвешенным парно-групповым методом UPGMA (unweighed pair-group method using arithmetic average) была построена дендрограмма, отражающая степень сходства исследуемых популяций по ISSR-спектрам при помощи компьютерных программ Treecon 1.3b. Генетическое расстояние между ценопопуляциями определяли по формуле M. Нея и В. Ли [10].

Результаты и их обсуждение

В четырех популяциях P. nigra выявлено 49 ISSR-PCR-маркеров, из которых 43 (P95=0,878) были полиморфными. Число амплифицированных ISSR-маркеров варьировало в зависимости от праймера от 12 (праймер CR-215, X10, M27) до 13 (праймер M3), а их диапазон длин от 210 до 740 пн. Установлено, что число полиморфных маркеров в общей выборке изменялось от 10 до 12, а доля полиморфных локусов (P95) в зависимости от ISSR-праймера варьировала от 0,769 до 1. Наименьшая доля полиморфных локусов (P95=0,725) отмечена в популяции Pn_4, а наибольшая (P95=0,788) – в Pn_3.

Ожидаемая гетерозиготность () в общей выборке P. nigra составила =0,221. Наибольшие значения ожидаемой гетерозиготности (=0,233) отмечены в Pn_3, а наименьшие (=0,187) – в Pn_1. Абсолютное число аллелей (na) в общей выборке равно 1,878, а эффективное число аллелей (ne) ? 1,494. Максимальный показатель (na =1,593) отмечен в популяции Pn_3, а минимальный (na = 1,550) – в Pn_1. Наибольшее значение эффективных аллелей (ne) выявлено также в популяции Pn_4 и составило 1,425, а наименьшее – в Pn_1 и оказалось равным 1,302.

Для характеристики генетического разнообразия популяций важны редкие (R), то есть встречающиеся с частотой менее 5%, маркеры. В изученных популяциях P. nigra выявлено 6 редких ISSR-маркеров, которые равномерно распределены (R=2) в популяциях Pn_1, Pn_2, Pn_4, а в Pn_3 они отсутствовали.

Все вышеперечисленные данные свидетельствуют о том, что популяция Pn_3, произрастающая вблизи г. Стерлитамак, характеризуется более высоким уровнем генетического разнообразия в сравнении с другими изученными популяциями (HE = 0,233; ne=1,425; R=2), а популяция Pn_1 («Спасская гора») – наиболее низкими показателями генетического разнообразия (HE = 0,187; ne = 1,302; R=0).

В результате молекулярно-генетического анализа популяций тополя чёрного на основании полиморфизма микросателлитных последовательностей наибольшие показатели генетического разнообразия (na = 7,667; ne = 3,948; = 0,715) были также выявлены в Pn_3, а наименьшие ? в Pn_1 (na=4,167; ne=2,585), но наименьшей ожидаемой гетерозиготностью (HE = 0,517) обладает популяция Pn_4 [3].

Анализ генетической структуры четырех популяций P. nigra показал, что общее генное разнообразие или ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей выборке (HT) составило 0,291, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции (HS) ? 0,221. Показатель подразделённости популяций () невысок и равен 0,239 (табл.). Наименьшее генетическое расстояние между исследуемыми популяциями P. nigra отмечено между Pn_2 «Бирск» и Pn_3 «Стерлитамак» (D=0,132), наиболее генетически удаленными являются популяции Pn_1 «Спасская гора» и Pn_3 «Стерлитамак» (D=0,242).

Генетическая структура и дифференциация четырех популяций P. nigra

ISSR-

праймер

Нуклеотидная

последовательность

(5'→ 3')

M3

(AC)8CT

0,266 (0,039)

0,207 (0,024)

0,222

X10

(AGC)6C

0,217 (0,035)

0,168 (0,023)

0,229

M27

(GA) 8C

0,330 (0,028)

0,254 (0,016)

0,229

CR-215

(СA)6GT

0,351 (0,012)

0,256 (0,010)

0,270

На общую выборку

0,291 (0,030)

0,221 (0,019)

0,239

Примечание: – ожидаемая доля гетерозиготных генотипов как мера общего генного разнообразия во всей популяции; – ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия или среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; – доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения

На дендрограмме (рисунок) популяции Pn_2 «Бирск» и Pn_3 «Стерлитамак» образуют один кластер, к ним примыкает популяция Pn_4 «Инзер», в свою очередь, Pn_1 – «Спасская гора», самая северная из изученных популяций,представлена отдельной ветвью.

Дендрограмма исправленная

UPGMA-дендрограмма по ISSR-спектрам четырех изученных популяций P. nigra,

где Pn_1 – «Спасская гора», Pn_2 ? «Бирск», Pn_3 – «Стерлитамак», Pn_4 – «Инзер»; шкала сверху – генетические дистанции по формуле M. Нея, В. Ли [10], цифрами указаны значения бутстрепа

Анализ генетической структуры и дифференциации популяций тополя чёрного на основании полиморфизма SSR-PCR-маркеров показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей популяции (НT) равна 0,759, аналогичный показатель в субпопуляции (НS) составляет 0,615. Показатель подразделённости популяций (GST) равен 0,168. Следовательно, 16,8% генетического разнообразия приходится на межпопуляционную компоненту, а 83,2% - на внутрипопуляционную [3].

На основании результатов выполненного исследования для сохранения и возобновления генетических ресурсов P. nigra можно рекомендовать третью популяцию (Pn_3), произрастающую вблизи г. Стерлитамак, обладающую наиболее высокими показателями генетического разнообразия (=0,233; =1,425; R=2). При отборе деревьев для лесовосстановления необходимо учитывать их генотип, а также наличие редких ISSR-маркеров, которые наряду с другими молекулярными маркерами могут быть использованы и для идентификации популяций. Для сохранения генетического разнообразия тополя чёрного на популяционном уровне необходимо учитывать генетическую структуру популяций и уровень внутри- и межпопуляционной дифференциации. В целях сохранения генетического разнообразия популяции Pn_1 (=0,187; =1,302; R=0), расположенной в историко-природном комплексе «Спасская гора» в зоне островной Кунгурской лесостепи на Среднем Урале, а также Pn_4, произрастающей на территории Южно-Уральского заповедника в горном районе Южного Урала, необходимо соблюдение мер охраны, предусмотренных статусом ООПТ.

Заключение

В ходе исследований генетического полиморфизма популяций P. nigra с применением ISSR-метода анализа полиморфизма ДНК было установлено, что вид характеризуется высокой долей полиморфных локусов (=0,878), но средними значениями ожидаемой гетерозиготности (=0,221) и эффективного числа аллелей (=1,494). Самые высокие показатели доли полиморфных локусов (=0,788), значения эффективных аллелей (=1,425) и ожидаемой гетерозиготности (=0,233) отмечены в популяции Pn_3 в окрестностях г. Стерлитамак. А популяция Pn_1 на территории ООПТ «Спасская гора» обладает самым низким значением ожидаемой гетерозиготности (=0,187), а также эффективных аллелей (= 1,302). Низкая доля полиморфных фрагментов (=0,725) отмечена в популяции Pn_4 на территории Южно-Уральского заповедника вблизи г. Инзер. Установлено, что все изученные популяции P. nigra характеризуются средним уровнем генетической подразделенности (=0,239). На основании полученных результатов даны рекомендации по сохранению генетического разнообразия популяций P. nigra на Среднем и Южном Урале. Изучение генетической изменчивости природных популяций древесных растений может быть использовано для составления генетически обоснованных программ по сохранению, восстановлению и рациональному использованию лесных генетических ресурсов.

Работа выполнена при финансовой поддержке задания 2014/153 государственных работ в сфере научной деятельности в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки России (проект 144, № гос. рег. 01201461915).