Аденомиоз является одним из наиболее распространенных заболеваний, занимая в структуре гинекологической патологии третье место после воспалительных заболеваний и миомы матки. По данным ряд авторов, частота его составляет от 12 до 50 % [2,5,7]. Концепция клиники, тактики ведения, пато- и мор­фогенеза аденомиоза подробно обсуждаются в литературе не одно десятилетие. [3,6], однако многие аспекты данной проблемы остаются малоизучен­ными. Практически отсутствуют сведения о молекулярно-биологических особенностях процессов неоангиогенеза и экспрессии факторов роста, отражающих ремоделирование стромы в аденомиозе [3]. В данном этапе развития медицины, учитывая важную роль матриксных металлопротеиназ (ММР) в ремоделировании тканей и органов, представляет интерес их регулирование в репродуктивных органах женщин. Известно более 20 видов ММР, которые осуществляют различные этапы деградации коллагена, эластина и других белков экстрацеллюлярного матрикса. Среди них особую роль играет интерстициальная коллагеназа (матриксная металлопротеиназа-1, ММР-1), которая осуществляет первичную деградацию молекул коллагена, после чего происходит их дальнейший распад под действием остальных ММР, в частности, стромелизина-1 (ММР-3) [3,10]. Значительную роль в ремоделировании тканей матки играют также факторы системы гемокоагуляции, которые, как правило, являются специализированными протеазами, осуществляющими активацию факторов каскада свертывания крови и фибринолиза. В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение распространенности генных вариантов металлопротеиназы-1(ММР-1) (1G/2G) и ингибитора активатора плазминогена-1(PAI-1) (4G/5G) у пациенток с различными клиническими вариантами течения аденомиоза для выявления значения генетических факторов в патогенезе аденомиоза.

Материалы и методы. В настоящее исследование включены 150 больных с внутренним эндометриозом тела матки. Критерием включения в исследование пациенток явилось: наличие диффузного аденомиоза у женщин репродуктивного и перименопаузального возраста (на основании тщательного анализа клинико-анамнестических и инструментально-диагностических данных: эхографическое, допплерометрическое, гистероскопическое обследование с пункционной биопсией миометрия). Возраст больных составлял от 32 до 48 лет (41±2,5 года). Длительность клинических проявлений заболевания была от нескольких месяцев до 10 лет. Основными симптомами заболевания были обильные и длительные менструации у 34 (22,7 %) пациенток, скудные темно-коричневые выделения до и (или) после менструации у 97 (64,7 %) женщин, болезненные менструации у 58 (38,7 %) обследованных. У 73 (48,7 %) больных отмечались тазовые боли различной интенсивности и у 33 (22 %) женщин – диспареуния. Первичное бесплодие имело место у 14(9,3 %) женщин, а вторичное – у 19 (12,7 %). Известно, что аденомиоз часто сопровождается маточными кровотечениями, приводящими к анемизации больных. Исходя из полученных данных, показатель уровня гемоглобина в пределах 125–110 г/л наблюдался у 116 (77,3 %) пациенток с внутренним эндометриозом тела матки. Показатель уровня гемоглобина 109–100 г/л отмечала 34(22,7 %) больных с аденомиозом. При определении размеров матки получили следующие результаты: у 58 (38,7 %) пациенток матка coответствовала размерам 5–6 н.б., у 61 (40,7 %) больных – 7–8 н.б., у 31 (20,6 %) женщин – 9–12 н.б. Средняя величина матки в среднем составила 7,8+1,2 н.б. 49 пациенткам производилась экстирпация матки, вопрос об удалении придатков решался индивидуально. Основными показаниями для проведения гистерэктомии у обследованных больных с аденомиозом были: маточные кровотечения у 34 больных (69,4 %); сильные тазовые боли у 15 пациенток (30,6 %); постгеморрагическая анемия у 34 больных (69,4 %); отсутствие эффекта от проведенной терапии аГнРГ у 37 (75,5 %).

Ультразвуковое исследование органов малого таза проводили с помощью ультразвукового диагностического прибора SonolineG40, фирмы Siemens с использованием трансвагинального датчика (частота 6,7мГц). При ультразвуковом исследовании определяли размеры матки, толщину и структуру миометрия, эндометрия, размеры яичников. После проведения биометрии матки и яичников осуществляли цветное допплеровское картирование с последующей оценкой кривых скоростей кровотока в маточных артериях. Для устранения низкочастотных сигналов, производимых движениями стенок сосудов, применяли фильтр 100 Гц. Общая мощность допплеровского излучения не превышала 100 мВт/см². Ультразвуковое исследование органов малого таза и допплерографию проводили на 20–23 дни менструального цикла. Для качественного анализа спектральных кривых скоростей кровотока оценивали ИР – индекс резистентности. Операционную гистерорезектоскопию (фирмы Olimpys) с биопсией миометрия выполняли пациенткам с монополярной петлей резектоскопа. Захватывали участки миометрия в области визуализируемых железистых ходов (при их отсутствии – в нескольких произвольных точках на разных стенках полости матки).

Морфологические исследования были выполнены у всех 49 оперированных больных. Срезы операционного материала окрашивались гематоксилином-эозином, пикрофуксином для выявления соединительной ткани. Просмотр микропрепаратов осуществлялся на микроскопе МИКМЕД-2,видиограммы получены с помощью автоматического анализатора изображения ВИДИО-ТЕСТ-2,0. При определении функционально активного и неактивного типовэндометриоидных гетеротопий использовали морфологическую классификацию предложенная И.И. Куценко[4], которая позволяет выделять следующие формы заболевания: пролиферирующую, стабильную (фиброзную), регрессирующую (дистрофическую).

Оценка распространенности генных вариантов матриксной металлопротеиназы-1(ММР-1) (1G/2G) и ингибитора активатора плазминогена-1(PAI-1) (4G/5G) проведена у 150 больных с аденомиозом. Группу популяционного контроля составили 200 жительниц Санкт-Петербурга и Ленинградской области. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов крови больных и доноров с применением набора «ДНК-Сорб» («Литех», Москва). Тип промоторного полиморфизма генов ММР-1 (1G/2G), PAI-1 (4G/5G) определяли с помощью аллель-специфической полимеразной цепной реакции ДНК (ПЦР ДНК). Продукты ПЦР после электрофореза оценивали в агарозном геле при окраске этидий-бромидом.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием общеупотребительных методов параметрической и непараметрической статистики. Методы описательной (дескриптивной) статистики включали в себя оценку среднего арифметического (М), средней ошибки среднего значения (m) – для признаков, имеющих непрерывное распределение; а также частоты встречаемости признаков с дискретными значениями. Для оценки межгрупповых различий значений признаков, имеющих непрерывное распределение, применяли t-критерий Стьюдента. Анализ зависимости между признаками проводили с помощью r-критерия Пирсона (где r=0,3-0,5 – умеренная, r=0,5-0,7–значительные и r=0,7-0,9–сильно выраженная связь). Статистическая обработка материала выполнялась на ЭВМ с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windowsv. 6.0). Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

Результаты исследования и обсуждение

Анализ распределения изученных генных вариантов показал высокую частоту встречаемости альтернативных аллелей генов ММР-1, PAI-1 у обследованных больных cаденомиозом. Получены результаты, свидетельствующие о высокой частоте встречаемости генотипа 1G/1G ММР-1 в группе женщин 25 (16,7 %), находившихся в перименопаузе и имевших по данным анамнеза неактивное течение заболевания (малые, стабильные размеры матки, невысокая частота меноррагий). Основными симптомами были скудные темно-коричневые выделения до и (или) после менструации и альгодисменорея. Размеры матки в данной группе больных coответствовала размерам 5–6 н.б. При анализе допплерометрических характеристик кровотока ИР в маточных артериях в среднем составил ИР=0,83±0,01. Кроме того, было обнаружено, что у больных стабильным течением заболевания отмечалась повышенная встречаемость генотипа 1G/1G гена ММР-1, тогда прогресс аденомиоза ассоциировался с пониженной частотой данного аллеля (р=0,02). Молекулярно-генетическое исследование установило роль гиперактивных генных вариантов матриксной металлопротеиназы-1 в прогрессирование аденомиоза. Наличие у 92 (61,3 %) пациенток гомозиготного (2G/2G) или гетерозиготного (1G/2G) состояния гена ММР-1 ассоциировано с прогрессированием заболевания. Основными симптомами у пациенток из данной клинической группы были обильные и длительные менструации и болевой синдром. Размеры матки у 31 пациенток в данной группе больных coответствовала размерам 9–12 н.б., у 61 больных – 7–8 н.б. При анализе допплерометрических характеристик кровотока ИР в маточных артериях в среднем составил ИР=0,70±0,02. При исследовании частоты встречаемости различных генотипов гена PAI-1 у пациенток с различными клиническими течениями аденомиоза была обнаружена достоверная ассоциация между наличием аллеля 5G гена PAI-1 и пролиферирующей формой заболевания (р=0,04). При анализе гаплотипов MMP-1/PAI-1 у обследованных больных с аденомиозом было обнаружено, что сочетание аллелей 2G ММР-1 и 5GPAI-1 коррелировало с прогрессированием заболевания и достоверно чаще встречалось у больных с пролиферирующей формой аденомиоза (р=0,05) по сравнению с 33 (22 %) больными, имевшими стабильную или фиброзную форму опухоли. У пациенток, имевших стабильную или фиброзную форму опухоли, основными симптомами были: скудные темно-коричневые выделения до и (или) после менструации, альгодисменорея и диспареуния. Размеры матки у всех пациенток в данной группе coответствовали размерам 5–6 н.б. При анализе допплерометрических характеристик кровотока ИР в маточных артериях в среднем составил ИР=0,79±0,02.

Среди 49 оперированных больных генотип 1G/1G ММР-1 имели 8(16,3 %) женщин, находившихся в перименопаузе, имевших по данным морфологии регрессирующий (дистрофический) тип опухоли и 10 (20,4 %) больных, имевшими стабильную или фиброзную форму опухоли, находившихся в репродуктивном периоде. У 31(63,3 %) оперированных пациенток пролиферирующей формой аденомиоза выявили гомозиготное (2G/2G) или гетерозиготное (1G/2G) состояния гена ММР-1 и сочетание аллелей 2G ММР-1 и 5GPAI-1. При макроскопическом исследовании матка была округлой или бугристой формы, увеличена в основном за счет утолщения задней (61,2 %) и передней стенок, обусловленного наличием аденомиоза. Консистенция маки в большинстве случаев была неравномерно плотной. На разрезе в миометрии очаги аденомиоза имели вид участков уплотнения ячеистого строения, без капсулы и четких границ, представляющих собой инфильтраты и кистозные образования. В ряде случаев в толще миометрия имелись мелкие (0,3–0,8 см) полости с геморрагическим содержимым. Очаги аденомиоза были представлены железистыми структурами различной величины и стромой окружаю­щей железы, которая имела цитогенный характер и со­стояла из многочисленных фибробластоподобных кле­ток с различным содержанием коллагеновых волокон. Характерным было наличие множества тонкостенных сосудов. Как правило, стромальный компонент преобла­дал над железистым. Преобладание стромального компонента в основном отмечалось в группе 31(63,3 %) пациенток клинически активным проявлением, у которых морфологически верифицирована пролиферирующая форма аденомиоза. Вокруг очагов аденомиоза обнаруживались характерные изменения миометрия: гипертрофия миоцитов, формирование периваскулярных зон роста, сходных с наблюдаемыми в миомах. Функционально активные эндометриоидные гетеротопии часто располагались вблизи гетеротопий, в кото­рых эпителий не имел признаков функциональной актив­ности, что согласуется с данными Унанян А.Л. [7].

Молекулярно-генетическое исследование изменений генной активности у больных аденомиозом обнаружило значимую роль определенных генных полиморфных вариантов гена матриксных металлопротеиназ (ММР-1) и гена ингибитора активатора плазминогена типа 1 (PAI-1) в развитии различных клинических форм течения заболевания [1], что показало значимость в патогенезе аденомиоза механизмов регуляции процессов ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса. Экстрацеллюлярный матрикс, являющийся супрамолекулярным комплексом, образующим внеклеточное окружение, влияет на дифференцировку, пролиферацию, организацию и прикрепление клеток. Он включает в себя интерстициальный коллаген, протеогликаны, фибронектин, ламинин и другие крупномолекулярные соединения. При опухолевом росте в миометрии происходят изменения экспрессии ряда генов внеклеточного матрикса, что ведет к усиленному накоплению коллагена, мукополисахаридов. Ультраструктура коллагеновых фибрилл в ткани аденомиоза имеет нетипичное строение, ориентацию и отличается от ткани нормального миометрия [9]. Матриксные металлопротеиназы участвуют в процессах ремоделинга коллагена в опухолевых тканях, осуществляя различные этапы деградации коллагена, эластина и других белков экстрацеллюлярного матрикса [3,10]. Полиморфизм регуляторных участков физиологически значимых генов существенно изменяет транскрипционную активность генов, продукцию мРНК и специфических белков, что приводит к усилению генной активности. В нашем исследовании установлена роль гиперактивных генных вариантов матриксной металлопротеиназы-1 в развитии клинически активных форм аденомиоза [1]. Наличие у пациенток гомозиготного (2G/2G) или гетерозиготного (1G/2G) состояния гена ММР-1 ассоциировано с усиленной склонностью к диссеминации новообразования и, следовательно, к развитию прогресса заболевания. Напротив, носительство низкоактивного аллеля 1G (генотип 1G/1G) играет протективную роль в развитии клинически активных форм аденомиоза. При носительстве аллеля 2G у больных наблюдается более активная продукция проэнзима ММР-1, это приводит к активации коллагенолиза и увеличивает вероятность инвазии клеток эндометрия в прилежащие области с их последующим эктопическим ростом. Кроме того, процессы неоангиогенеза, играющие важную роль в патогенезе аденомиоза и миомы матки, прогрессируют при усилении активности матриксных металлопротеиназ [8]. Участвуя в процессах деградации матрикса при росте тканей, они тем самым формируют пространства для прорастания в межклеточном матриксе новых капилляров, обеспечивающих питание новообразований. Значительную роль в ремоделировании тканей миометрия играют также факторы гемокоагуляции, которые являются специализированными протеазами, осуществляющими активацию факторов каскада свертывания крови и фибринолиза. Результаты изучения нами полиморфизма гена ингибитора активатора плазминогена типа 1 (PAI-1) показали значение наличия аллеля 5G, характеризующегося умеренной транскрипцией и, следовательно, невысоким уровнем индукции PAI-1, в развитии клинически значимых форм аденомиоза. Кроме того, обнаружена корреляция прогресса заболевания с наличием у больных ассоциации аллелей 2GMMP-1/5GPAI-1. Роль указанных полиморфных вариантов в патогенезе клинически значимых форм заболевания связана с изменением процессов фибринолиза. Наличие аллеля 5G гена PAI-1 характеризуется низкой экспрессией белка и, таким образом, при этом в меньшей степени ингибируется выработка плазмина, что приводит к усилению образования активной матриксной металлопротеиназы-1 из ее предшественника [10].

Выводы

Таким образом, молекулярно-генетическое исследование изменений генной активности у больных аденомиозом обнаружило значимую роль определенных генных полиморфных вариантов гена матриксных металлопротеиназ (ММР-1) и гена ингибитора активатора плазминогена типа 1 (PAI-1) в развитии различных клинических форм течения заболевания, что показало значимость в патогенезе аденомиоза механизмов регуляции процессов ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса. Наличие у пациенток гомозиготного (2G/2G) или гетерозиготного (1G/2G) состояния гена ММР-1 и сочетание аллелей 2G ММР-1 и 5GPAI-1 характерно для пролиферирующей формы аденомиоза и прогресса заболевания. Определение полиморфных генных вариантов MMP-1 и PAI-1 может быть использовано в целях прогноза течения заболевания.