В последние годы благодаря достижениям научно-технического прогресса появились перспективы создания эффективных лекарственных препаратов на основе лекарственных растений с использованием технологий, обеспечивающих максимальное извлечение действующих веществ. Одним из источников получения высококачественного средства является Pentaphylloides fruticose L., имеющий обширный ареал, неприхотливый к условиям среды (растение-мезофит, холодоустойчиво и способно произрастать в условиях вечной мерзлоты). Благодаря насыщенности биологически активными веществами, прежде всего, флавоноидами, танинами, полисахаридами, углеводами, аминокислотами, сапонинами тритерпеноидной группы и другими веществами, извлечения из побегов Пятилистника кустарникового активно используются в традиционной медицине как кровоостанавливающее, противовоспалительное, антибактериальное, гипогликемическое, регенерирующее, обезболивающее средство [2]. Широкий спектр фармакологических эффектов, в частности экстракта из указанного сырья, предопределил целесообразность применения линимента, полученного на его основе по инновационной технологии для лечения раневого процесса, а также мази, изготовленной по классической аптечной технологии.
Цель исследования: определить ранозаживляющее влияние мягких готовых форм из побегов Пятилистника кустарникового на модели плоскостной кожно-фасцильной раны.
Материалы и методы исследования: эксперименты проводили в соответствии с требованиями приказа №267 МЗ РФ (19.06.2003 г.) на белых крысах-самцах линии Wistar, массой 200–250 гр, у которых воспроизводили раневое повреждение кожи, после предварительной подготовки, путем нанесения плоскостных ран размерами 2,0 х 2,0 см. Протокол исследования одобрен комиссией по этике при институте общей и экспериментальной биологии СО РАН (заключение №17 от 09.07.15 г.). По принципу аналогов было сформировано 3 группы животных, находившихся в равноценных условиях кормления и содержания в виварии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. Оптимальное содержание экстракта в мягких формах установлено в предварительных опытах.
Животным 1-й группы на раны накладывали 5 % линимент экстракта побегов Пятилистника кустарникового, полученный на аппарате NanoDeBee 30. Указанное средство в дозе 100 мг наносили на раневой дефект 1 раз в сутки, в течении 14 дней. Животным 2-й опытной группы применяли препарат сравнения – 5 % мазь на основе экстракта побегов Пятилистника кустарникового, произведенной по аптечной технологии, в аналогичной дозе и схеме. В 3-й (контрольной) группе обработка ран осуществлялась в аналогичном режиме глицерин-вазелиновой мазью в соотношении 2:3 (основа мягких форм) в дозе 100 мг.
Для исследований использовали биоптаты с зоны ран, взятые на 7, 14 и 21 сутки. Полученный материал фиксировали в 10 % водном растворе нейтрального формалина. Срезы толщиной 5–7 мкм готовили на санном микротоме с последующей окраской гематоксилином и эозином [5]. Для выявления коллагеновых волокон срезы окрашивали по Ван-Гизону [1]. Гистологические препараты изучали с использованием микроскопа МБИ-3. Обращали внимание на строение эпителия, сосочкового слоя, дермы, характер формирования сосудов и волосяных фолликулов. Количество клеточных элементов в рубцующейся ткани подсчитывали, используя окулярную сетку. Скорость контракции раневого дефекта на 7, 14 и 21 сутки эксперимента определяли планиметрическим методом: на рану накладывалась прозрачная рентгеновская пленка, на которой маркером фиксировался контур дефекта, площадь контура в квадратных миллиметрах измеряли путем наложения на миллиметровую бумагу (Попова Л.Н., 1942 г.). Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием компьютерной программы “Microsoft Office Excel 2007”. Различия в сравнении данных опытных групп с контролем считали значимыми при р< 0.05.
Результаты исследований и их обсуждение
У животных первой и второй группы на 7 сутки наблюдения неповрежденный участок ткани, расположенный на расстоянии от раны, имел нормальное строение, характеризующееся правильным расположением стромы, сосудов. В пограничной зоне на этот срок в непосредственной близости от раны видны многочисленные капилляры, которые в зависимости от плоскости сечения имели округлую, овальную или вытянутую форму. В области раны наблюдали значительные разрастания неправильно расположенных пучков коллагеновых волокон, веретенообразных клеток фиброцитов. Следует отметить увеличение вновь образованных капилляров по направлению к поверхности раны. Отчетливо визуализируется активная эпителизация раны, происходящая путем нарастания эпителия на раневую поверхность со стороны сохранившихся клеток с краев раны. Данная картина соответствует классическому пути заживления поверхностной раны (в данном случае плоскостной) [3,9]. Следует отметить, что митозы эпителиальных клеток в области краев ран еще малочисленны, их значительно больше в стороне от краев раневого дефекта. Эпителиальный пласт, покрывающий дефект кожи, состоял из пяти – шести слоев клеток, волоконца имели менее плотную структуру, чем на неповрежденном участке. Сосочки эпидермиса крупнее, чем в зоне без повреждений, неправильной формы. По контурам сосочкового слоя были расположены базальные клетки. Необходимо указать, что четкость стратификации эпидермиса у крыс первой и второй групп выражена значительно лучше, чем в контрольной группе. Дерма в первой группе состояла из формирующих коллагеновых волокон и аморфного вещества, что свидетельствует о начале активной фазы регенерации [6]. Микроскопически определяется четкое отграничение дермы от эпидермиса базальной мембраной, в ней отчетливо заметны кровеносные сосуды. Дерма без резкой границы переходит в подкожную жировую клетчатку. В регенератах на этот период опыта наблюдали производные элементы кожи – волосяные фолликулы и сальные железы. Дерма содержала большое количество артериол и венул. Причем, количество сосудистых элементов в 1 группе превосходило число артериол и венул во 2 группе и особенно – в контрольной группе. Сочетание в данный период времени процесса контракции раны с интенсивной эпителизацией кожного дефекта подтверждает наиболее эффективное действие линимента на течение раневого процесса.
Через 14 суток эксперимента клеточные элементы в ране у животных 1 группы были представлены в основном фибробластами и фиброцитами. Фибробласты дифференцируются как крупные клетки, чаще вытянутой формы, фиброциты имели более округлую форму. Уровень организации коллагена также высок – сформированные пучки коллагена расположены параллельно и косо направлены к поверхности, они переплетаются друг с другом, главным образом, в горизонтальной плоскости. Данная картина свидетельствует об эффективной стадийности раневого процесса в данном случае [4,8]. Причем, морфологическая картина в 1 и 2 группах на указанный срок опыта уже имеет определенные отличия. Это подтверждает подсчет клеточных элементов и сосудов в раневом биоптате (табл.1). Количество фиброцитов и фибробластов, а также соотношения молодых и зрелых форм коллагенпродуцирующих клеток в 1 группе вкупе с высокой степенью васкуляризации раны свидетельствуют о высоких темпах регенеративных процессов. В дерме количество венул относительно одинаковое в 1 и 2 группах животных, но число артериол максимально высокое в 1 группе, значимо меньшее – во 2 группе, в контрольной группе меньше – в 3 раза.
Течение раневого процесса у крыс контрольной группы характеризовалось замедленными темпами регенеративных процессов. На 21 сутки эксперимента гистологический статус имел следующий вид: эпителиальный пласт, закрывающий раневой дефект лишь на эти сроки, состоял из пяти – шести слоев, они были расположены неравномерно, имелись утолщенные участки, дифференциация эпидермиса на слои была слабо выражена, сосочки базального слоя имели неправильную форму. Дерма состояла из формирующихся коллагеновых волокон с имеющимися участками переплетения, их формирование более выражено ближе к краю дефекта. Необходимо отметить, что в этой группе не наблюдаются производные элементов кожи (волосяные фолликулы и сальные железы).
Таблица 1
Показатели состояния рубцующейся ткани при применении мягких форм из побегов Пятилистника кустарникового при раневом повреждении кожи у крыс
|
Показатель |
Группы животных |
||
|
1 группа (линимент), 14 сутки (n=8) |
2 группа (мазь), 14 сутки (n=8) |
3 (основа) группа, 14 сутки (n=8) |
|
|
Фибробласты |
48,8+0,85* |
42,7+0,54* |
37,2+1,14 |
|
Фиброциты |
114,5+0,65* |
112,3+0,62* |
90,1+1,11 |
|
Венулы |
52,1+0,90* |
43,4+0,32 |
46,3+0,65 |
|
Артериолы |
69,2+0,71* |
46,3+0,65* |
23,3+1.12 |
* – здесь и далее означает, что различия по сравнению с контролем значимы (Р<0,05); n – количество животных в группе.
Указанные данные согласуются с результатами планиметрии. Данные наблюдений, представленные в таблице, свидетельствуют, что на всех сроках исследования площади ран у крыс, получавших лечение 5 % линиментом экстракта побегов Пятилистника кустарникового, полученного на аппарате NanoDeBee30, сокращаются (табл. 2).
Таблица 2
Влияние линиментов Пятилистника кустарникового на величину площади плоскостной раны у белых крыс
|
Сутки эксперимента |
Площадь ран, мм2 |
||
|
Линимент Пятилистника кустарникового, изготовленный на аппарате NanoDeBee30 |
Линимент Пятилистника кустарникового, произведенного по аптечной технологии |
Глицерин-вазелиновая основа (контроль) |
|
|
7 |
245.0+2.30* (n=8) |
287,0+4.80 (n=9) |
325,0+4.83 (n=8) |
|
14 |
95.8+4.20* (n=8) |
141,0+5.05 (n=8) |
187.0+3.40 (n=8) |
|
21 |
50.0+3.71* (n=8) |
75.0+2.97* (n=8) |
145.0+5.80 (n=8) |
Так, в серии опытов, где у крыс, которым применяли линимент Пятилистника кустарникового, изготовленного на аппарате NanoDeBee30, площадь раневой поверхности была на 24,62 % меньше, чем у крыс, которым применяли глицерин-вазелиновую основу мази, на 14 сутки эксперимента разница составляла уже 48,78 %, а на 21 сутки площадь ран у крыс при применении линимента Пятилистника кустарникового, изготовленного на аппарате NanoDeBee30, уменьшилась более чем на 2/3 в сравнении с контролем. Показатели динамики ранозаживления у животных с аптечной формой линимента на основе Пятилистника кустарникового также демонстрировали позитивный эффект лечения. В частности на 14 сутки опыта плоскостная рана уменьшилась на 24,6 % относительно контроля, а на 21 сутки разница в площади составила 48,27 %.
Выводы
Полученные результаты свидетельствуют, что применение готовой формы линимента экстракта Пятилистника кустарникового, полученного на аппарате NanoDeBee 30, обеспечивает наиболее ранее заживление и формирование рубца по сравнению с мазью, произведенной по аптечной технологии. Биоптат, полученный у животных 3 (контрольной) группы, только на 21 сутки эксперимента соответствовал картине, близкой наблюдаемой у животных 1 группы на 14 день. Несомненная эффективность линимента с частицами, близкими к наноформе, обусловливающая ускоренное заживление раневого дефекта, делает данную готовую форму перспективной для применения в качестве эффективного ранозаживляющего средства в клинике.