В последние годы в отечественной литературе опубликован целый ряд статей об успешном опыте применения лекарственных препаратов, включающих в свой состав аскорбат хитозана – соль аминополисахарида хитозана (ХТЗ) и аскорбиновой кислоты (АК) [1, 2]. Как известно, ХТЗ обладает ранозаживляющим, противовоспалительным и биоцидным (антибактериальным, противовирусным и фунгицидным) действием [8, 9], что является крайне важным, в частности, при лечении воспалительных заболеваний пародонта и ран различного генеза. Выбор АК в качестве органического лиганда в составе соли обусловлен прежде всего ее способностью определять нормальное течение репаративных процессов за счет стимуляции синтеза коллагена и пролиферации фибробластов.

Одной из особенностей соли аскорбата ХТЗ является то, что она образована из двух оптически активных химических соединений. Аминополисахарид ХТЗ проявляет оптическую активность вследствие наличия асимметрично замещенных атомов углерода в глюкопиранозных циклах макромолекул. Асимметрический атом углерода в фурановом кольце молекулы АК обусловливает существование двух оптических энантиомеров – право- и левовращающего изомера, условно именуемых L- и D-изоформами. Причем, в природных объектах АК находится исключительно в биологически активной L-изоформе (витамин С), тогда как при химическом синтезе, как правило, получается рацемат – смесь равных количеств L- и D-изоформ. В отношении D-АК в литературе имеются отдельные экспериментальные данные о ее слабой коллагенстимулирующей активности и низкой скорости поступления в организм [10]. В этой связи вполне логично было бы ожидать, что препараты, содержащие АК в виде смеси L- и D-стереоизомеров, могут существенно отличаться своими фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами, и это не может не отразиться на эффективности проводимого лечения.

Известно также, что стереоизомеры лекарственных веществ могут существенно различаться своим терапевтическим эффектом, и не всегда он оказывается благоприятным. Так, например, D-соталол оказывает антиаритмическое действие, а L-соталол является альфа-блокатором; D-этамбутол используется в качестве противотуберкулезного препарата, в то время как прием L-этамбутола приводит к слепоте. Поэтому само существование явления стереоизомеризма лекарственных веществ инициировало развитие целого направления исследований в области клинической фармакологии, основной целью которого является сравнение эффективности и безопасности как отдельных энантиомеров, так и их рацемической смеси [7].

Не так давно было установлено, что взаимодействие ХТЗ с АК пространственно отличается от его взаимодействия с другими органическими или неорганическими кислотами [5]. Вопрос о влиянии хиральности АК на биологическую активность полимера ХТЗ остается практически не изученным.

Данная работа посвящена сравнению антибактериальной активности L- и D-изоформ АК и их солей с ХТЗ.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили водные растворы L- и D-изоформ АК, а также водные растворы их солей с ХТЗ. В качестве исходных субстанций использовали L- и D-аскорбиновую кислоту (C6H8O6) производства ООО «Люми» (г. Санкт-Петербург) и ЗАО «Вектон» (г. Санкт-Петербург), соответственно, аналитической степени чистоты, а также порошок водорастворимого хитозана (ХТЗ) со средневязкостной молекулярной массой 32 кДа и степенью деацетилирования 70 мольн.% (ЗАО «Биопрогресс», г. Щелково). Проведенный дополнительный химический анализ коммерческого порошка ХТЗ показал, что он представлен полисолью гидрохлорида ХТЗ (ХТЗ·HCl). Навески ХТЗ·HCl предварительно стерилизовали в ламинарном боксе NUAIRE Biological Safeti Cabinets (Франция) в течение 15 мин. При приготовления растворов использовали стерильную дистиллированную воду, дегазированную от CO2 и О2 кипячением при 100 °С в течение 1 часа.

Исходные 9 %-ные растворы L- и D-изоформ АК получали растворением навесок L- и D-АК в воде при 20 ± 2 оС в отсутствие естественного освещения. Исходные растворы гидрохлорида-аскорбата ХТЗ (ХТЗ·HCl·АК) готовили порционным смешиванием твердой навески ХТЗ·HCl с 9 %-ным водным раствором L- или D-АК в количестве, обеспечивающем мольное соотношение ХТЗ·HCl : АК = 1 : 0.6. В эксперименте использовали суточные растворы L- и D-АК и их солей ХТЗ·HCl·D-АК и ХТЗ·HCl·L-АК.

Антибактериальную активность полученных препаратов определяли методом, разработанным С. Е. Есиповым с соавторами [3]. Для этого в застывшем мясопептонном агаре, содержащем взвесь клеток суточной бактериальной тест-культуры (108 к.т. в 1 мл по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича), делали шесть лунок диаметром 7 мм по окружности чашки Петри на расстоянии 30–33 мм от центра (рисунок). В три лунки (через одну) вносили по 0.1 мл контрольного препарата (стандарта) – 0.05 %-ного раствора хлоргексидина биглюконата (производство ООО «Южфарм», РФ). В три другие лунки вносили по 0.1 мл водных растворов L- и D-изоформ АК или растворов солей ХТЗ·HCl·D-АК и ХТЗ·HCl·L-АК в разведениях, указанных в таблице. На каждый испытуемый препарат брали по пять чашек с тест-культурами Staphylococcus aureus 209P и Escherichia coli 113-13. Для лучшей диффузии испытуемых препаратов в питательную среду чашки с нанесенными образцами сначала выдерживали в течение 2-х часов при комнатной температуре, а затем помещали в термостат на 37 оС. Зоны задержки роста бактерий замеряли через 18–20 часов культивирования. Эксперимент повторяли троекратно.

Зоны угнетения роста культуры S. aureus 209P водными растворами соли ХТЗ·HCl·L-АК концентрации 9 (1), 4.5 (2), 2.25 % (3) и стандартом – 0.05 %-ным раствором хлоргексидина биглюконата

Антибактериальную активность (Аi, %) анализируемых образцов рассчитывали в точном соответствии с тем, как это указано в статье [4]. Все вычисления и статистическую обработку данных проводили с помощью программ Microsoft Excel (пакет ПО Microsoft Office 2010) и StatSoft Statistica v6.0 Rus (2006).

Результаты исследования и их обсуждение

Предложенный С.Е. Есиповым с соавт. [3] и модифицированный В.М. Игидбашян с соавт. [4] математический алгоритм обработки данных позволяет рассчитывать величину антибактериальной активности Аi относительно опорной концентрации какого-либо стандарта, то есть антибиотика или антисептика, биоцидная активность которого известна. В данной работе в качестве стандарта был выбран 0.05 %-ный раствор хлоргексидина биглюконата, применяющийся в медицине в качестве асептического средства для лечения ран, потертостей, трещин, ожогов, бактериальных и грибковых заболеваний кожи и слизистых оболочек.

В таблице приведены значения Аi исследуемых растворов в отношении тестовых культур двух видов микроорганизмов – грампозитивного S. aureus 209P и грамнегативного E. coli 113-13. Важно отметить, что во всех экспериментах коэффициент корреляции ri2 имел величину не менее 0.99, что свидетельствовало о наличии линейной зависимости между логарифмом дозы препарата, внесенной в лунки питательного агара, и диаметром зон подавления роста. Следовательно, указанные в таблице значения Аi были определены с относительной ошибкой не более 5 % [3].

Значения антибактериальной активности (Ai) водных растворов L- и D-изоформ аскорбиновой кислоты (АК) и их солей с гидрохлоридом хитозана (ХТЗ·HCl), рассчитанные относительно 0.05%-ного раствора биглюконата хлоргексидина, ri2=0.99

_________________________

Примечание. dst – среднее значение диаметра зон подавления роста контрольным стандартным раствором для девяти измерений; Ci – экспериментально определенное значение концентрации препарата в трех разведениях анализируемого образца относительно концентрации контрольного стандартного раствора.

При сравнении значений величины Аi у стереоизоформ АК было установлено, что биоцидная активность раствора L-АК по сравнению раствором D-АК была выше и в отношении штамма E. coli 113-13 (в 1.9 раза, p ≤ 0.05), и в отношении S. aureus 209P (в 2.1 раза, p ≤ 0.05). Иная картина наблюдалась при воздействии на культуры бактерий растворов солей стереоизоформ АК и ХТЗ·HCl. Оказалось, что раствор ХТЗ·HCl·L-АК по сравнению с раствором ХТЗ·HCl·D-АК был в 3.2 раза менее активен в отношении культуры S. aureus 209P (p ≤ 0.05) и в 7.5 раза – в отношении E. coli 113-13 (p ≤ 0.05).

При сравнении антибактериальной активности стереоизомеров АК и соответствующих им полимерных солей было установлено, что антибактериальная активность D-АК была статистически значимо ниже по сравнению с ХТЗ·HCl·D-АК: в отношении S. aureus 209P – в 1.7 раза; в отношении E. coli 113-13 – в 2.2 раза. В то же время, значения Аi у L-АК были существенно выше таковых у ХТЗ·HCl·L-АК: в 6.3 раза (p ≤ 0.05) в отношении E. coli 113-13 и в 4.0 раза (p ≤ 0.05) в отношении S. aureus 209P.

Более чувствительным к действию растворов стереоизомеров АК оказался грамнегативный микроорганизм E. coli 113-13. Значения величины антибактериальной активности в отношении этого штамма у растворов L-АК и D-АК были, соответственно, в 1.3 раза (p ≥ 0.05) и в 1.5 раза (p ≤ 0.05) выше, чем таковые в отношении грампозитивного S. aureus 209P. Статистически значимых различий в чувствительности к биоцидному действию растворов ХТЗ·HCl·L-АК у тестируемых культур установлено не было. Отношение значений Аi, рассчитанных для S. aureus 209P и для E. coli 113-13, у этой полисоли составляло величину 1.3 (p ≥ 0.05). В то же время, к действию растворов ХТЗ·HCl·D-АК штамм E. coli 113-13 проявлял бóльшую чувствительность по сравнению с S. aureus 209P – в 1.9 раза, причем p ≤ 0.05.

Заключение

Проведенное микробиологическое исследование продемонстрировало существенное изменение биоцидных свойств раствора комплексной соли гидрохлорида-аскорбата ХТЗ в зависимости от знака удельного оптического вращения стереоизомера АК, использованного при ее приготовлении. Из всех протестированных нами растворов самой высокой антибактериальной активностью обладала соль ХТЗ·HCl·D-АК. Это вполне согласуется с опубликованным ранее наблюдением, что наибольшую биологическую активность проявляют растворы солей ХТЗ, имеющие малое по модулю отрицательное значение удельного оптического вращения [6]. Как показали А. Б. Шиповская с соавт. (2015), водные растворы ХТЗ·HCl в L-АК и D-АК имеют отрицательные значения [α], причем кривая дисперсии удельного оптического вращения раствора ХТЗ·HCl·D-АК (мольное соотношение ХТЗ·HCl:АК – 1:2) в большей степени смещена в область, где величина [α] приближается к 0 [5].

Большинство исследователей склоняются к мнению, что антибактериальная активность у ХТЗ определяется положительно заряженными аминогруппами (–NH3+) мономерных звеньев макроцепи аминополисахарида, которые обеспечивают связывание полимера с анионными компонентами поверхностных структур клеток микроорганизмов [8, 9]. В этом случае главной мишенью для ХТЗ у грамотрицательных бактерий становится отрицательно заряженный липополисахарид, у грамположительных – тейхоевые кислоты с многочисленными отрицательно заряженными остатками фосфорной кислоты. В наших экспериментах наиболее высокие значения антибактериальной активности были отмечены у L-стререоизомера АК (Аi = 45.7 %) и у ХТЗ·HCl·D-АК (Аi = 54.7 %) в отношении грамнегативного микроорганизма E. coli 113-13. Физическая сущность наблюдаемого нами явления, к сожалению, пока не имеет объяснения, и требуются дополнительные исследования. Можно лишь предположить, что стерические особенности органического лиганда являются критичными для установления полноценного взаимодействия протонированных аминогрупп ХТЗ с сайтами связывания на поверхности клеток грамнегативных и грампозитивных микроорганизмов.