Более ста лет назад John Beard предложил «трофобластную теорию рака», основанную на сходных биологических особенностях клеток трофобласта и раковых клеток. Эта теория предсказывает, что раковые клетки могут возникать из зародышевых клеток, которые не в состоянии завершить свою эмбриональную миграцию к гонадам. Известные на сегодняшний день факты подтверждают подобие между развитием половых и раковых клеток. Существуют экспериментальные данные, согласно которым ряд опухолей человека секретирует хорионический гонадотропин человека [48].
Дополнительные доказательства трофобластной теории рака были получены после открытия белковых антигенов, которые присутствуют только в зародышевых клетках, трофобластах и опухолях. Эти антигены первоначально описали как раковые тестикулярные (РТ) антигены на основании тканевой локализации их паттерна экспрессии (тестикулярная локализация). Однако последние данные позволяют предположить, что эту группу генов более правильно рассматривать как раково-герминальные (РГ) антигены, так как они обычно экспрессируются в эмбриональных яичниках [18]. Обнаружение РГ (или РТ) антигенов подтверждает теорию, согласно которой одной из причин онкогенеза является ненормальная активация генов гамет в соматических клетках.
В последние десятилетия усилия сообщества онко-иммунологов были направлены на поиски тумор-ассоциированных антигенов (ТАА), способных вызвать направленный против опухоли иммунный ответ, и создание соответствующих вакцин. Значительные успехи были сделаны в области идентификации ТАА человека, распознаваемых Т-клетками. В начале 1990-х годов, Бун и др. сообщили о первом успешном клонировании антигена опухоли человека, названного меланомным антигеном-1 (MAGE-1). MAGE-1 вызывал специфический ответ аутологичных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) у пациента с меланомой [53].
Раковые тестикулярные антигены (РТА) или Cancer Testis Antigens (CTA) представляют собой большое семейство опухолевых антигенов, экспрессирующихся в опухолях человека различного гистологического происхождения, а в нормальных тканях – только в семенниках и плаценте. Такая топически ограниченная экспрессия вместе с естественными сильными иммуногенными свойствами превращают РТА в идеальную мишень для разработки специфических иммуно-терапевтических подходов при лечении опухолей. Разработано несколько ДКВ-вакцин с использованием РТА, проходящие клинические испытания [1; 2; 64; 65]. В связи с интересом для практического применения в последнее время были предприняты значительные усилия для более детального изучения характеристик биологии РТА. На сегодняшний день идентифицировано 70 семейств РТА, включающих в себя около 140 членов. Большинство из этих РТА экспрессируются в процессе сперматогенеза, но их функции до сих пор неизвестны. По всей видимости, эпигенетические события, особенно метилирование ДНК и пост-транскрипционная регуляция, являются основными механизмами, контролирующими экспрессию РТА в нормальных, онко-трансформированных, а также в раковых стволовых клетках.
Цель данного обзора – общий анализ и предоставление информации об основных механизмах регуляции экспрессии РТА и выполняемых ими функциях, знание которых может быть полезно для создания новых вакцин и оптимизации их работы при лечении онкологических заболеваний. Фармакологическое воздействие на профили экспрессии РТА опухолевыми клетками с помощью ДНК гипометилирующих препаратов обсуждается в качестве возможного подхода для использования в новых схемах комбинированной терапии потенциально способных улучшить эффективность иммунотерапии онкологических пациентов.
1. Экспрессия РТА в нормальных и раковых тканях
В тканях семенников гены Х- РТА экспрессируются, прежде всего, в сперматогониях – пролиферирующих половых клетках, в то время как non-X- РТА экспрессируются на более поздних стадиях дифференцировки, например, в сперматоцитах [48]. В дополнение к экспрессии в тестикулах, экспрессия MAGE-A3, MAGE-A8, MAGE-A10, XAGE-2и XAGE-3 была найдена в плаценте [6]. Показано, что некоторые соматические ткани, такие как поджелудочная железа, печень и селезенка экспрессируют мРНК нескольких РТА. Тем не менее, на основании результатов данных количественной RT-PCR, уровни мРНК генов РТА в соматических тканях составляют, как правило, <1 % от их экспрессии в семенниках [6; 42].
РТА широко распространены в опухолях различных гистотипов. Имеющиеся данные основаны, главным образом, на анализе их транскриптов и демонстрируют, что экспрессия РТА в опухолях значительно варьирует как по степени выраженности, так и по качественному составу паттернов экспрессии. Согласно данным RT-PCR, члены различных семейств и супер-семейств РТА в основном экспрессируются в клетках меланомы, опухолях мочевого пузыря и немелкоклеточного рака легкого, умеренно экспрессируются в опухолях молочной железы и простаты, слабо экспрессируются в опухолях почки и толстой кишки [41, 42], а также в гематологических опухолях, таких как первичная эффузионная лимфома, ходжкинская и неходжкинская лимфомы [7,16]. По всей видимости, РТА MAGE-A1,MAGE-A3, NY-ESO-1, SSX-2 и SSX-4 экспрессируются наиболее часто, в то время как BAGE, GAGE-A1 и SCP-1 – редко [41]. Частота обнаружения мРНК генов NY-ESO-1 составляет от 17 до 42 % в меланомах [8; 37; 44], от 32 % до 80 % при раке мочевого пузыря [29; 42], приблизительно 27 % при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) [19], и от 2 до 10 % при раке толстой кишки [30]. В то же время экспрессию РТА не идентифицировали в почечно-клеточной карциноме и лимфоме [8]. Аналогично, транскрипция MAGE-A3 была отмечена в 57–76 % меланом [5; 17; 36; 44], 35–60 % НМРЛ [34; 40], 57 % случаев рака мочевого пузыря [53], в 75 % случаев плоскоклеточного рака пищевода [59] и в 42 % гепатокарцином [9]. Активность гена BAGE была обнаружена в 21 % гепатокарцином [28], в 17–20 % НМРЛ [34; 52], в 14 % – 28 % меланом [4; 37; 44] и в 15 % случаев рака мочевого пузыря [41]. По некоторым данным в различных опухолях наблюдается множественная ко-экспрессия РТА [19]. Исследование, проводившееся с целью оценки экспрессии РТА в опухолях молочной железы и меланомы, показало, что экспрессия РТА отсутствовала в 47 % опухолей молочной железы и 26 % меланом, а в 40 % случаев рака молочной железы и 65 % меланом наблюдалась экспрессия, по меньшей мере, трёх РТА [39]. В то время как 11 из 33 опухолей легких не продемонстрировали экспрессии ни одного из исследованных РТА, 19 из 22 РТА –положительных опухолей легкого экспрессировали, по крайней мере, два РТА, а 13 из 22 экспрессировали три РТА-маркера [40]. Статистически значимой связи между экспрессией исследованных РТА (MAGE-A2, -А3 и -A4, GAGE-1-6, BAGE, NY-ESO-1 и PRAME) в различных метастатических образованиях 53-х пациентов с меланомой выявлено не было [44].
В дополнение к анализу мРНК методом RT-PCR, экспрессия некоторых РТА была исследована на протеомном уровне с помощью иммуногистохимических методов (ИГХ), показавших хорошую корреляцию с результатами экспрессии мРНК [23,30; 35]. Использование ИГХ-метода позволяет исследовать топику внутриопухолевой распространенности РТА, что демонстрирует внутриопухолевую неоднородность экспрессии РТА при онкологических заболеваниях. Менее чем 50 % опухолевых клеток окрашивается anti-MAGE-A1, анти-NY-ESO-1 или анти–SSX моноклональными антителами в большинстве РТА -положительных опухолей разных гистотипов [14; 23, 32].
2. Регуляция экспрессии РТА
Эпигенетические события представляют собой уникальный механизм обратимой и регулируемой экспрессии РТА как в нормальных, так и опухолевых клетках [22]. Термин «эпигенетические» относится к наследственным изменениям в экспрессии генов, которые не являются результатом изменений нуклеотидной последовательности геномной ДНК [1; 25; 44]. Метилирование ДНК, пост-трансляционные модификации гистонов и микроРНК-сайленсинг генов на сегодняшний день – наиболее полно охарактеризованные эпигенетические факторы, контролирующие экспрессию РТА.
2.1. Метилирование ДНК
Метилирование ДНК – общераспространенная модификация, приводящая к угнетению транскрипционной активности гена. Процесс метилирования ДНК млекопитающих реализуется ДНК-метил-трансферазами (DNMT) путём ковалентного присоединения метильной группы к цитозину в составе цитозин-гуаниновых динуклеотидов (CpG) в позиции 5’-углеродацитозинового кольца. Метилирование ДНК может стать причиной транскрипционного подавления генов в результате прямого нарушения связывания специфических факторов транскрипции с ДНК [57] или из-за присоединения метил-CpG-связывающих белков (MBD). MBD предотвращают транскрипцию генов путем привлечения хроматин ремоделирующих ко-репрессорных комплексов [21; 55; 56; 63]. Все исследованные гены РТА имели метилированные промоторы в нормальных, не-экспрессирующих РТА соматических тканях, и активировались путем деметилирования во время сперматогенеза [12]. Первые доказательства того, что экспрессия РТА (MAGE-1) регулируется метилированием ДНК, были получены Weber и соавт. В этой работе было продемонстрировано, что применение ДНК гипометилирующего агента (ДГА) 5-аза-2-дезоксицитидина (5-AZA-CdDR) активировало экспрессию denovoгена MAGE-A1 в клеточной линии меланомы человека [58]. Дальнейшие исследования показали, что экспрессия гена MAGE-A1 коррелирует со статусом метилирования его промотора в неопластических клетках различных гистотипов [11]. Также для разных членов MAGE-A и NY-ESO показана инвариантная ассоциация экспрессии со статусом гипометилирования их промоторов в исследованных опухолях и клеточных линиях [11; 13;20; 44]. Доказательства того, что статус метилирования промоторов РТА является ведущим молекулярным механизмом регуляции экспрессии РТА, получены в экспериментах по трансфекции репортерных генов, управляющих РТА промоторами, и в экспериментах по метилированию/деметилированию invitro. В целом было продемонстрировано, что метилирование – единственный фактор, ограничивающий активность промотора РТА в раковых клетках [10,44]. Статус метилирования промоторов непосредственно отвечает за выраженную неоднородность внутри опухолевой экспрессии РТА, что часто наблюдается в меланомах человека [45]. Эта неоднородность метилирования промоторов наследуется в дочерних поколениях одной клетки [15]. Связь между гипометилированием ДНК промоторов и экспрессией РТА была подтверждена в популяциях стволовых клеток меланомы, что свидетельствует в пользу участия эпигенетической регуляции в контроле экспрессии генов РТА в раковых стволовых клетках [47].
2.2. Модификация гистонов
Модификация гистонов играет важную роль в эпигенетической регуляция экспрессии РТА [25; 46; 62]. Гистоны – это белки, содержащие гибкие N-концевые участки, выступающие из нуклеосомы, которые служат мишенью для пост-трансляционных модификаций, в том числе ацетилирования и метилирования.
2.2.1. Ацетилирование гистонов
Статус ацетилирования гистонов контролируется сбалансированным действием гистон-ацетилтрансфераз (histoneacetyltransferases – ГАТ), добавляющих ацетильные группы кN-концевым остаткам лизина, и гистоновых деацетилаз (histonedeacetylases – ГДА), играющих противоположную роль. Регуляция транскрипции путем ацетилирования довольно проста: ацетилирование гистонов приводит к разуплотнению хроматина и транскрипции генов, в то время как дезацетилирование приводит к уплотнению структуры хроматина и ассоциируется с репрессированием генов [22]. Эксперименты invitro показали, что ингибирование ГДАспецифическими ингибиторами (ГДАИ) ассоциировано с незначительным воздействием на экспрессию РТА в злокачественных опухолях человека. Однако некоторые данные продемонстрировали небольшое влияние на экспрессию генов MAGE-A и up-регуляцию транскрипционной активности метилирования и деметилирования промоторов MAGE-A2 и -A12 генов после введения HDACi [62]. Подтверждает основную роль ГДА в функциональной модуляция экспрессии РТА, при комбинированном воздействии на раковые клетки различных гистотипов ГДА и HDACi и небольшой синергический эффект, в результате которого сочетанное воздействие этих агентов увеличивает уровни мРНК РТА по сравнению с воздействием только ГДА [43; 46; 60; 61].
2.2.2. Метилирование гистонов
Метилирование гистонов также регулирует экспрессию генов. Метилирование гистонов включает добавление метильных групп кN-терминальным остаткам аргинина и лизина и, в отличие от ацетилирования гистонов, связано как с активацией транскрипции, так и с репрессией, в зависимости от того, какой аминокислотный остаток модифицирован [38]. Первое исследование потенциальной роли метилирования гистонов в регуляции генов РТА продемонстрировало, что нокаутгистоновых метилтрансфераз (ГМТ или GLP), которые являются мишенью эухроматиновых локусов и катализируют H3K9 деметилирование (H3K9me2), был достаточным воздействием, чтобы индуцировать экспрессию генов MAGE-A в мышиных эмбриональных стволовых клетках [50; 51].
2.3 МикроРНК
МикроРНК – семейство небольших по размеру молекул РНК (от 19 до 21 нуклеотидов), негативно регулирующих экспрессию (RISC) и транскрипцию (RITS) многих генов.
3.1. МикроРНК-874 как опухолевый супрессор
Раковый тестикулярный антиген HCA587/MAGE-C2 рассматривается в качестве эффективной опухоль-специфичной мишени для иммунотерапии. Как было установлено, HCA587/MAGE-C2 играет активную роль в онкогенезе, стимулируя рост и выживаемость опухолевых клеток. Тем не менее механизмы регуляции экспрессии HCA587/MAGE-C2 в раковых клетках остаются в значительной степени неизвестными. Были проведены поиски микроРНК, регулирующих экспрессию гена HCA587/MAGE-C2. Эксперименты продемонстрировали, что мРНК гена HCA587/MAGE-C2 является прямой мишенью для микроРНК-874 (MIR-874). В то же время отмечена значительная отрицательная регуляция транскрипции микроРНК-874 в опухолевых тканях по сравнению с соседними нормальными тканями. В итоге избыточная экспрессия микроРНК-874 и, как следствие, подавление транскрипционной активности гена HCA587/MAGE-C2, приводит к угнетению пролиферативной и инвазионной активности опухолевых клеток. Более того, эффект угнетающего воздействия микроРНК-874 на пролиферацию и инвазию клеток мог быть обратимым при возобновлении экспрессии гена HCA587/MAGE-C2 в клетках линии А375. Таким образом, эти данные наглядно демонстрируют, что HCA587/MAGE-C2 является прямой мишенью для микроРНК-874, которая может функционировать в качестве опухоль-супрессорной микроРНК, по крайней мере, частично, путем негативной регуляции транскрипционной активности гена HCA587/MAGE-C2 в онко-трансформированных клетках [49].
3.2. miR-200b как регулятор опухолевой супрессии
Раково-тестикулярные антигены или раково-ассоциированные гены (cancer-associated gene CAGE), участвуют в различных клеточных процессах, таких как пролиферация, подвижность клеток, а также ответственны за устойчивость клеток к противораковой терапии, однако механизм регуляции экспрессии CAGE остается неизвестным. Скрининговый модельный анализ позволил предсказать связывание микроРНК-200b (MIR-200В) с промоторами генов CAGE. Экспрессия генов CAGE продемонстрировала отрицательную корреляцию с транскрипционной активностью гена микроРНК-200b в различных линиях раковых клеток, что не исключает того, что микроРНК-200b служит эффективным сайленсером CAGE. МикроРНК-200b связывается с 3’-UTR CAGE и регулирует экспрессию этой группы генов на уровне транскрипции. В лабораторных условиях также было продемонстрировано, что эта микроРНК повышает чувствительность к действию препаратов, разрушающих микротрубочки клеток. В целом микроРНК-200b и CAGE оказывали противоположное действие на инвазию и реакцию на лекарственные противомикротрубочковые препараты. Эксперименты на ксено-трансплантатах показали, что микроРНК-200b отрицательно влияет на онкогенный и метастатический потенциал раковых клеток. При этом влияние на метастатический потенциал клеток реализовывалось на уровне регуляции экспрессии группы генов CAGE. МикроРНК-200b снижает онкогенный потенциал линий раковых клеток, резистентных к лекарственным препаратам, имеющим своей мишенью микротрубочки клеток, что также связано с понижением регуляции группы генов CAGE. Исследования хроматиновой иммуно-преципитации показали прямое регулирование со стороны микроРНК-200b на группу генов CAGE [26].
МикроРНК-200b отрицательно регулирует опухолевый ангиогенез. Эпигенетическое ингибирование генов CAGE приводит к понижению экспрессии PAI-1 (ингибитор плазминогена 1), белков, взаимодействующих с TGFb, вовлеченных в ангиогенез, а также VEGF (семейство эндотелиальных факторов роста сосудов). CAGE – опосредованный опухоль – индуцированный ангиогенез необходим для VEGF-зависимого ангиогенеза. Человеческий рекомбинантный белок CAGE проявляет ярко выраженный ангиогенный потенциал. Таким образом, микроРНК-200b и группа генов CAGE образуют отрицательную регуляторную петлю и регулируют реакцию клеток на лекарственные препараты, имеющих своими мишенями микротрубочки, а также на инвазионный, онкогенный потенциалы, и ангиогенез [26].
Заключение
Экспрессия раковых тестикулярных антигенов создаёт благоприятные предпосылки для лечения онкологических заболеваний методами иммунотерапии. Выяснение механизмов регуляции транскрипционной активности генов РТА в онко-трансформированных клетках необходимо для создания эффективных терапевтических подходов, позволяющих усилить иммуногенность опухолевых клеток при использовании деметилирующих агентов (5-aza-CdR) или, наоборот, подавить экспрессию микроРНК, таргетирущих транскрипцию РТА генов.