При остром описторхозе значительная часть исследований периферической крови посвящена количественным изменениям клеточного состава (гемограмма, лейкоцитарная формула) [1; 5]. Качественные изменения форменных элементов крови при остром описторхозе не достаточно изучены. Морфологические изменения эозинофилов на интактных клетках in vitro при описторхозе констатируются как дегрануляция их цитоплазмы, с повышенной вакуолизацией ядра и цитоплазмы [8]. Изменения периферической крови включают эозинофилию и имеют характер лейкемоидной реакции [5]. Установлено, что при описторхозе нарушается состояние системы свертывания крови, обусловленное нарушением функций кровяных пластинок, однако изменение их структуры не дается [2]. Форме эритроцитов при описторхозе не уделяется должного внимания. В литературе отсутствуют подробные данные о морфологии всех форменных элементов при остром описторхозе in vivo. Модификация тинкториальных свойств форменных элементов при остром описторхозе в литературе не отмечена. Морфологические изменения периферической крови, происходящие при остром описторхозе, и их анализ в динамике ранее не описаны.
Цель: провести исследование и сравнительный анализ цитоморфологии периферической крови при остром описторхозе в разные сроки наблюдения.
Материалы и методы
Объектом исследований служили мазки периферической крови, взятые от зараженных животных. Работа проведена на 30 половозрелых беспородных кроликах-самцах. Животные однократно получили мышечную ткань рыб, зараженную метацеркариями Opisthorchis felineus из расчета по 50 личинок на одну особь. Материал снулой рыбы (видовая принадлежность – язь) получен с кафедры ихтиологии и гидробиологии Томского государственного университета. Выделение и контроль жизнеспособности проводили в компрессориуме под световым микроскопом ООО «Альтами», ТУ 9443-002-89017513-2009 на увеличении ×100. Взятие периферической крови производили в утренние часы натощак из капилляров от краевой вены правого уха животных. При работе с животными авторы руководствовались «Правилами проведения работ и использованием экспериментальных животных». Работа одобрена Этическим комитетом ФГБОУ ВО «КемГМУ» Минздрава России. Подтверждение состоявшейся инвазии Opisthorchis felineus проводили анализами кала по Като и методом Parasep с обнаружением яиц паразита. Фиксацию мазков периферической крови производили по Романовскому (Азур-Эозин) «Минимед – Р» фирмы «МиниМед» (ТУ 9398-003-29508133-11) г. Брянск, окрашивание по Май-Грюнвальду красителем Эозин-метиленовый синий «Минимед – М-Г» фирмы «МиниМед» (ТУ 9398-003-29508133-11) г. Брянск. При исследовании периферической крови от каждого животного получали по 3 мазка в каждый срок (через 6, 27 суток, на 32, 39-е сутки). При выборе сроков исследования руководствовались клиническими данными протекания инвазии. При оценке морфологического строения форменных элементов крови учитывали строение цитоплазмы и ядра, их тинкториальные свойства. У лейкоцитов оценивали наличие и степень выраженности токсической зернистости (для псевдоэозинофилов), наличие вакуолизации цитоплазмы, наличие телец Князькова-Деле, форму и количество сегментов ядер, клетки лейколиза, наличие патологических клеточных форм. У эритроцитов, кровяных пластинок – изменение формы, окраски, размеров, наличие и виды включений, не менее чем в 10 полях зрения. Цитологическое исследование лейкоцитов, не менее чем в 100 клетках, проводили в каждом препарате методом меандров.
Результаты и обсуждение. При исследовании цитоморфологии периферической крови кроликов через 6 суток после заражения Opisthorchis felineus были выявлены следующие изменения: в цитоплазме сегментоядерных псевдоэозинофилов обнаружили выраженную зернистость, гранулы грубые, с тенденцией к слиянию. Их размеры визуально больше, чем у животных контрольной группы. Распределение гранул по цитоплазме не равномерное. В отличие от оксифильной зернистости псевдоэозинофилов контрольной группы у клеток опытной группы окраска части гранул была азурофильной, с легкой степенью метахромазии. Данную зернистость охарактеризовали как токсическую, средней степени выраженности. Ядро псевдоэозинофилов насчитывало в среднем 3-5 сегментов, соединенных нитевидными перемычками. Цитоплазма псевдоэозинофилов имела небольшие участки, лишенные гранул. Отдельные клетки в цитоплазме содержали множественные вакуоли, что придавало им «пенистый» вид. По мнению авторов, токсическая зернистость возникает вследствие интоксикации, при инфекционных и воспалительных процессах [1]. Сочетание токсической зернистости и вакуолизации цитоплазмы нейтрофилов выделяют при асептическом воспалении [7]. Токсическая зернистость является результатом резкой стимуляции продукции клеток, из-за чего время созревания ускоряется [8]. Вероятно, структурные изменения цитоплазмы псевдоэозинофилов связаны не только с локальным воспалительным процессом, инициированным инвазией, но и с раздражением кроветворных органов как собственными продуктами распада, так и токсинами паразита. Эозинофилы крови кроликов экспериментальной группы имели 3-4 сегмента ядра, а у контрольной группы – 2-3 сегмента. Цитоплазма содержала крупные резко оксифильные гранулы. Гранулы имели просветленную зону в центре. Цитоплазма эозинофилов частично не содержала специфической зернистости. У базофилов выявлены аналогичные эозинофилам изменения цитоплазмы. Их ядра просматривались и имели слабодольчатую форму. Вероятно, отсутствие специфической зернистости в небольшом объеме у эозинофилов и базофилов связана с аллергической сенсибилизацией вследствие воздействия антигенов паразита. В цитоплазме средних лимфоцитов отмечали единичные светлые вакуоли средних и крупных размеров. Количество форм лимфолиза - теней Боткина-Гумпрехта-Клейна в этот срок было вариативно – 4-8%. Цитоплазма моноцитов содержала единичные светлые вакуоли.
Кровяные пластинки визуальных особенностей не имели. Хромомер базофильной окраски локализовался в центре, по периферии располагался светлый гиаломер. Контуры кровяных пластинок четкие, форма неправильная. Они были расположены немногочисленными группами.
Эритроциты кроликов обеих групп имели достаточно вариабельные размеры, микроциты и макроциты встречались среди нормоцитов. У кроликов обеих групп через 6 суток отмечали разницу в окраске эритроцитов – гипо- и гиперхромные формы чередовались с нормохромными. Установлено, что для кроликов полихромазия и анизоцитоз не является проявлением патологии [9; 10].
Среди обычных клеточных форм в этот срок в периферической крови были обнаружены не типичные клетки в количестве 10%. Они имели неправильную форму, очень крупные размеры, визуально были больше моноцитов крови в 2-3 раза. Ядро этих клеток лежало эксцентрично, имело овальную форму. Цитоплазма клеток была очень нежная, слабо базофильной окраски, содержала пылевидную базофильную зернистость. Клетки располагались в мазке группой. Вероятно, это гистиофагоциты моноцитарного типа. Но по сравнению с моноцитами структура их ядер была более грубая, резкой базофильной окраски. Выход в периферическую кровь тканевых фагоцитов является определенным парадоксом, поскольку моноциты крови уходят в ткани в норме и дифференцируются в макрофаги. Обратный процесс, возможно, является отображением специфического ответа на воздействие паразита, который для данного хозяина является нетипичным. Или же имеет место их образование из моноцитов непосредственно в крови, что также является парадоксальным. Появление гистиоцитов описано в начальном этапе воспалительных процессов в соединительной ткани [7].
Через 27 суток у животных экспериментальной группы сегментоядерные псевдоэозинофилы сохраняли токсическую зернистость. Отмечали наличие значительного количества разрушенных клеточных форм, их гранулы в виде россыпи располагались рядом с ядром. В отдельных клетках присутствовали ободки цитоплазмы без зернистости. В отличие от предыдущего срока, в цитоплазме содержались лишь единичные светлые вакуоли. Наоборот, множественную вакуолизацию цитоплазмы отмечали теперь у средних лимфоцитов. По сравнению с предыдущим сроком, теперь их цитоплазма приобрела «ячеистый» вид. У малых лимфоцитов была выявлена базофильная пунктуация цитоплазмы. Количество теней Боткина-Гумпрехта-Клейна составляло 2-6%, что меньше, чем в предыдущем сроке, в 1,5-2 раза. Базофилы, как и в раннем сроке, имели частично опустошенную цитоплазму, причем гранулы отсутствовали в основном в центре, сохраняясь по периферии клетки, вследствие чего ядро хорошо просматривалось. Форма ядра оставалась типичной. У эозинофилов цитоплазма, как и в предыдущем сроке, была только частично лишена гранул. Количество сегментов ядра достигало уже 5-6. Среди клеток крови были обнаружены формы раздражения – клетки Тюрка или плазмоциты. Их цитоплазма имела выраженную резко базофильную окраску. Ее структура была неравномерна, нитчато-сетчатая, без зернистости. Вокруг ядра присутствовала зона просветления. Ядро правильной круглой формы характеризовалось грубой структурой, глыбки хроматина резко контрастировали с небольшими светлыми промежутками кариоплазмы. Данные плазмоциты отнесли к лимфоидному типу. В отличие от предыдущего срока, гистиофагоциты были единичны (до 2%).
В этом сроке эритроциты имели разную форму. Среди нормоцитов встречались эритроциты звездчатой формы, с многочисленными короткими выростами по всему периметру, что характеризовало их как акантоциты. Другие, наоборот, были вытянутой листовидной формы. Окраска таких эритроцитов была гипохромной, а гиперхромные чаще имели сферическую форму и меньший размер. Бледность в центре последних не прослеживалась, следовательно, они являлись микросфероцитами. Кроме того, встречали эритроциты, форма которых имела вид капли (дакриоциты). Пойкилоцитоз при описторхозе ранее не описывался. Их наличие, вероятно, связано с цитотоксическим действием паразита на красный костный мозг. По данным литературы, акантоциты встречаются при тяжелых заболеваниях печени, а сфероциты – при имплантации и аутоиммунных заболеваниях, дакриоциты – при токсическом гепатите [11]. Вероятно, их наличие отражает системные морфологические изменения в органах кроветворения и иммуногенеза, связанные с секреторной дисфункцией как клеток печени, так и красного костного мозга и специфической стимуляцией всей иммунной системы в связи с токсическим влиянием чужеродных протеинов паразита. Отмечали в небольшом количестве эритроциты в виде «монетных столбиков». Вероятно, это проявление неустойчивой агрегации эритроцитов связано с повреждением противосвертывающей системы крови. Данное предположение подтверждалось и образованием кровяными пластинками больших конгломератов. Хотя их структура и форма внешне особенностей не выявляла. Развитие гиперкоагуляционных сдвигов, стаз и агрегация эритроцитов описаны только при хронизации описторхозной инвазии [2]. В данном случае эти события имеют место при остром описторхозе.
Изменения цитоморфологии периферической крови кроликов через 32 суток после заражения включали: сегментоядерные псевдоэозинофилы имели слабоокрашенные перемычки между сегментами ядра. В цитоплазме клеток сохранялась токсическая зернистость, с более резкой азурофильной окраской. Цитоплазма базофилов была практически без специфической зернистости. В ней оставались лишь единичные гранулы, крупных размеров и резкой базофильной окраски. Их локализацию наблюдали только по периферии, тогда как в центре клетки около ядра была пустая зона, подобная светлому окну. Также можно предположить, что это молодые базофилы, так как у незрелых клеток гранулы сосредоточены только по периферии, но форма и структура их ядра больше свидетельствуют о произошедшей дегрануляции уже зрелых клеток. Эозинофилы сохраняли зернистость цитоплазмы, содержащую лишь небольшие участки без гранул. Количество сегментов ядра, как и в ранний срок наблюдения, составляло 3-4. Лимфоциты крови образовывали псевдоподии. Появились средние лимфоциты, в ядре которых присутствовала небольшая выемка. Цитоплазма многих лимфоцитов была резко гиперхромна. Подобное изменение окраски цитоплазмы можно оценить как появление лимфоцитов в переходной стадии раздражения. Ядра малых лимфоцитов типичны по строению. Количество теней Боткина-Гумпрехта-Клейна, как в ранний срок наблюдения, вновь возрастало. Гистиофагоциты не встречались.
Изменения морфологического строения клеточного ряда периферической крови через 39 суток после заражения были достаточно разнообразны. В цитоплазме псевдоэозинофилов выявляли наличие светлых участков без гранул по периферии – телец Князькова-Деле, а в остальной части сохранялась выраженная токсическая зернистость. Количество сегментов ядра клеток насчитывало 6-7. Другие, наоборот, имели по 2 сегмента, количество таких клеток составляло 4%. Цитоплазма таких клеток тоже включала тельца Князькова-Деле. Цитоплазма базофилов практически полностью не имела гранул, вследствие чего хорошо визуализировалось слабо сегментированное ядро. У эозинофилов количество сегментов ядра достигало 5. Как и в предыдущие сроки, в их цитоплазме зернистость отсутствовала в незначительном объеме. В лимфоцитах, как и через 6 суток, вновь выявлены единичные вакуоли, находящиеся в больших и средних формах. У малых лимфоцитов цитоплазма с одного края имела оксифильную окраску. Количество теней Боткина-Гумпрехта-Клейна в этом сроке вариабельно – от 1 до 9. В этом сроке выявлены клетки Ридера. Эти лимфоциты имели двудольчатое ядро и слабобазофильную цитоплазму. Количество форм Ридера составляло 3-4 клетки на 100 встречаемых лейкоцитов. Наличие клеток Ридера в периферической крови при остром описторхозе в литературе не описано. Хотя указывается их появление как следствие преждевременного созревания и неправильности деления из-за ускорения кроветворения [3]. Асимметричность деления клеток выделяется авторами как одна из форм самоподдержания клеточной популяции гемопоэтических клеток, нарушение которой определено процессами преждевременного старения [4].
Нарушения в строении практически всех форменных элементов периферической крови, вероятно, связаны с цитотоксическим влиянием на кроветворные органы и системными нарушениями в работе иммунной системы, имеющими в качестве этиологического фактора различные метаболические сбои и адаптационную «дисплазию» крови в ответ на описторхозную инвазию.
Выводы
При оценке морфологического анализа периферической крови после заражения Opisthorchis felineus во всех сроках наблюдения сегментоядерные псевдоэозинофилы имели токсическую зернистость, что характеризует локально протекающее асептическое воспаление в организме, связанное с описторхозной инвазией. Вакуолизация цитоплазмы псевдоэозинофилов, а затем средних лимфоцитов также характеризует воспалительный процесс, сдвиг метаболических процессов, извращение процессов эндоцитоза. Высокая способность клеток к разрушению свидетельствует о нарушении в структурах мембраны. Различные изменения структуры ядра сегментоядерных псевдоэозинфилов, лимфоцитов являются следствием неправильной дифференцировки этих клеток в красном костном мозге вследствие общей интоксикации продуктами клеточного распада поврежденных органов и метаболитами паразита. Наличие и нарастание форм лимфолиза характеризует нарушения иммунной системы. В отличие от эозинофилов, у базофилов отсутствие специфической зернистости, возрастающее с увеличением срока наблюдения, характеризует большее участие последних в неспецифической аллергической сенсибилизации. Наличие форм Ридера, ранее не описываемое при остром описторхозе, подтверждает повреждение печени. Увеличение размера кровяных пластинок является показателем нарушения как тромбоцитопоэза, так и системы свертывания крови вследствие инвазии. Пойкилоцитоз, ранее не описываемый при описторхозе, вероятно, связан с нарушением работы кроветворных органов.